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1、辛巴蓝 F-3GA 修饰的啤酒废酵母菌亲和吸附溶菌酶摘 要 利用三嗪染料辛巴蓝 F-3GA 修饰经戊二醛交联的啤酒废酵母菌，得到一种新型染料亲和吸附剂。辛巴蓝 F-3GA 的固载量为 161 1 mg/g。以溶菌酶为研究对象，考察吸附时间、酶初始浓度、pH 值、离子强度等因素对吸附率的影响。结果表明: 当 pH =7 0 时，其对溶菌酶有较高的吸附量( 229 1 mg/g) ，吸附性能明显优于未接枝 F-3GA 的交联菌。负载的溶菌酶用 1 0 mol/L NaSCN 溶液洗脱，洗脱率高达 89 1%，酶活性保持率为 91 0%。将其用于鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化，酶活力收得率为 73 5%，
2、纯化倍数为 26 7。关键词 啤酒废酵母菌; 辛巴蓝 F-3GA; 染料亲和吸附; 溶菌酶1 引 言溶菌酶( Lysozyme) 是糖苷水解酶1，因其可选择性地分解微生物的细胞壁而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效，在食品工业、医疗、生物学等领域广泛应用2 4，常用于治疗慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘等疾病5。亲和吸附具有高选择性，可从复杂生物体系中高效、快速地分离出相应的目标产品，在蛋白分离纯化过程中有广阔的应用前景。目前，染料配基由于价格低廉，性质稳定，与蛋白结合容量大，已被固定在葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖等不同基质上，并成功用于脱氢酶、激酶、水解酶及血浆类蛋白的分离纯化6 8。但多数
3、基质性质不稳定，机械强度小，价格昂贵，预处理过程繁琐，而利用戊二醛交联的啤酒废酵母菌作为吸附基质，机械强度高，非特性吸附较小，廉价易得，既可增大吸附剂在实际中的应用范围，降低染料亲和吸附剂成本，还能减轻啤酒废水的处理负荷和难度。啤酒废酵母菌体表面保留了与活菌体相同的可修饰功能团，因而可实现戊二醛交联菌上辛巴蓝F-3GA 的接枝，制得一种新型染料亲和吸附剂。本实验考察了该吸附剂对溶菌酶的吸附性能，并将其用于鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化，结果满意。2 实验部分2 1 仪器与试剂RENISHAW in Via Raman Microscope( UK) ; LAMBDAB1035 紫外可见分光光度计(
4、美国珀金-埃尔默公司) ; SHZ-03 恒温水浴摇床( 上海堪鑫仪器设备有限公司) ; TGL-16G 台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) ; BX51 荧光电子显微镜( 日本奥林巴斯公司) ; MAXI-DRYLYO 真空浓缩( 冻干) 系统( 捷克 HETO公司) 。啤酒废酵母菌( 湖北某啤酒厂) ; 辛巴蓝 F-3GA，溶菌酶，溶壁微球菌干粉均购自 Sigma 公司; 其它试剂均为分析纯。2 2 实验方法2 2 1 戊二醛交联菌与辛巴蓝 F-3GA 修饰菌的制备 取 1 5 g 干燥的啤酒废酵母菌，加 50 mL 蒸馏水，振荡 1 h，加 2 mL 50%戊二醛溶液，于 30 水浴摇床
5、中振荡反应 14 h 后，以去离子水洗涤，冷冻干燥后得交联菌。在 100 mL 三颈瓶中加入1 0 g 交联菌，400 0 mg 辛巴蓝 F-3GA，40 mL 蒸馏水，于60 水浴中搅拌反应 30 min。加入 4 0 g NaCl，反应 30 min 后加入 0 4 gNa2CO3( 调 pH10 0) 继续反应 3 h，产物趁热第 39 卷2011 年 1 月分析化学 ( FENXI HUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第 1 期91 94抽滤，用水、乙醇和丙酮反复洗涤，40 真空干燥，得到蓝色修饰菌。2 2 2 吸附剂合
6、成条件优化 取交联菌 0 5 g，确定反应液总体积 20 mL，反应温度 60 ，加入 0 2 g无水 Na2CO3，按 2 2 1 节的方法进行三因素三水平正交实验，反应时间 ( 因素 A) 为 2、4 和 6 h; 辛巴蓝用量( 因素 B) 为 50 0、80 0 和 100 0 mg; NaCl 用量( 因素 C) 为 1 0、2 0 和 3 0 g。2 2 3 菌体表面形态及拉曼光谱表征 用荧光电子显微镜观察交联前后菌体表面形态变化。选择氩离子激光器，激光波长 514 nm，对修饰前后菌体进行拉曼光谱表征，比较拉曼谱图变化。2 2 4 吸附与洗脱实验 分别取 25 0 mg 干燥的交联
7、菌与修饰菌各 3 份，置于 3 个 50 mL 锥形瓶中，1 和 2 号各加入 10 mL 磷酸盐缓冲溶液，3 号加入 10 mL 0 4 g / L 溶菌酶溶液，放入 30 摇床，130 r / min 振荡吸附 4 h，取上清液。以 1 号作参比，2 号加入初始浓度的酶液作对照，用紫外分光光度计测定 280 nm 处的吸光度值，计算酶的吸附量。用不同浓度的 NaCl 和 NaSCN 溶液对吸附了溶菌酶的菌体洗脱。在上述移去上清液的 3 个锥形瓶中各加入 10 mL 洗脱剂，30 摇床振荡 4 h 后，取上清液，测定溶菌酶含量，计算洗脱率。2 2 5 鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化及酶活测定 取适
8、量新鲜鸡蛋清液，加入等体积的磷酸盐缓冲液( pH 7 0) ，搅拌均匀后，以 12000 r/min 离心 15 min 去杂质，取上清液 10 mL 做吸附洗脱实验。并按照文献9，在 25 ，pH 6 2，波长 450 nm 条件下，测定吸附洗脱前后纯酶液与鸡蛋清液的溶菌酶活力，计算活力收得率和纯化倍数。3 结果与讨论3 1 交联菌与修饰菌的表征3 1 1 显微形态 显微镜观察结果显示: 未交联酵母菌呈球状分散，菌体间聚集少; 交联后菌体间集结图 1 菌修饰前( a) 后和修饰( b) 的拉曼光谱图Fig 1 Raman spectra of unmodified ( a ) andmodi
9、fied ( b) yeast明显，细胞壁完好。表明菌体因戊二醛而交联，机械强度提高，也使其更易与水分离。3 1 2 拉曼光谱表征 由图 1 可见，交联菌经辛巴蓝 F-3GA 修饰后，出现了新的 Raman 谱带，证明修饰成功。1642 cm 1处的谱带应为 C N， C C 的伸缩振动; 1044和 1026 cm 1为苯环的面内弯曲振动。1163 与1325 cm 1分别为( C ) SO2的对称与反对称伸缩振动。表明辛巴蓝F-3GA 通过活泼的三嗪基氯与菌体表面羟基、氨基反应，并直接固载到交联酵母菌上。3 1 3 吸附剂合成条件优化 正交实验极差分析显示，辛巴蓝 F-3GA 用量对吸附剂
10、的性能影响较大，随着辛巴蓝F-3GA 用量的增加，吸附率逐渐增大。根据对溶菌酶的吸附效果数据分析，反应时间确定为 4 h，NaCl 用量确定为 2 0 g。辛巴蓝 F-3GA 用量确定为 200 0 mg。3 2 溶菌酶吸附行为的影响因素3 2 1 吸附时间 考察不同吸附时间下交联菌与修饰菌对溶菌酶的吸附速率( 见图 2a) 。吸附速度在初期较快，随后减慢，4 h 后吸附达饱和。由于吸附初期菌体表面暴露的吸附位点多，液相中溶菌酶的浓度较高。随着吸附的进行，吸附位点逐渐被占据，溶液中酶的浓度降低，吸附速率下降。3 2 2 溶菌酶初始浓度 图 2b 显示，随溶菌酶初始浓度的增大，吸附量增大。当初始
11、浓度为 1 5 g /L时，修饰菌达到最大平衡吸附量( 229 1 mg/g) 。与交联菌相比，修饰菌由于染料配体与酶的特异性作用，修饰菌的吸附量显著提高，也表明交联菌的非特异性吸附较小。3 2 3 pH 值 在 pH 5 0 8 5 范围内，溶菌酶分子带正电荷，随着 pH 值升高，修饰菌表面 SO2 3增加，使吸附量增大。由图 2c 可见，当 pH7 0 时，修饰菌吸附达饱和; pH = 7 0 时，交联菌吸附率仅40% ; pH 7 0 后，吸附量变化很大，这可能是因为交联形成的 Schiff 碱的作用。据文献10报道，pH 7 0 时，溶菌酶活性急剧下降。为保持溶菌酶活性，选定 pH =
12、 7 0。92分 析 化 学 第 39 卷3 2 4 离子强度 由图 2d 可知，随着离子强度的增加，溶菌酶的吸附量明显减小。这可能是因为离子强度的增加，使溶菌酶分子与配体结合的空间阻碍和静电排斥作用增大; 同时，盐离子也会与配体( SO2 3)作用，阻碍溶菌酶与配体的结合。大多数蛋白与染料配体间的作用力是特异性与非特异性吸附共存10。辛巴蓝 F-3GA 带有磺酸基和氨基，并有一定的芳香性，所以离子交换作用与疏水作用也同时存在。图 2 吸附时间( a) 、溶菌酶初始浓度( b) 、pH 值( c) 、离子强度( d) 对吸附的影响Fig 2 Effect of contact time ( a
13、) ，lysozyme ( LYS) initial concentration ( b) ，pH( c) ，ionic strength( d) onadsorption1 未修饰菌( Unmodified yeast) ; 2 修饰菌( Modified yeast) 。3 2 5 温度 在 15 45 范围内，随温度的升高，吸附率增大，溶液中分子热运动加剧，吸附量增加。当温度达到 20 后，吸附率变化不大，表明吸附可在较宽的温度范围内进行。3 2 6 溶菌酶洗脱及吸附剂的复用性 随洗脱液盐浓度的增加，洗脱率提高，当盐浓度为 1 0 mol /L时，NaCl 和 NaSCN 的洗脱率分别为
14、 70 7%和 89 1%。NaSCN 比 NaCl 有更好的解吸作用。一方面，盐浓度升高，离子强度增加，溶菌酶与染料配体间的静电结合减弱，同时，蛋白构象也会因离子强度的增加改变，导致蛋白质疏水作用减弱，促进解吸; 另一方面，SCN极易与蛋白质分子结合，大大促进了酶的脱附12。将吸附剂再生，多次重复吸附-洗脱，吸附率仅减少 5%，证明此染料亲和吸附剂具有良好的重复使用性能。3 3 鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化实验测得溶菌酶在吸附前后比活力分别为18667 和 16996 U/mg，活性保持率为 910%。从鸡蛋清中提取溶菌酶效果理想，活力收得率 73 5%，纯化倍数 26 7，实验重复 3 次，R
15、SD 分别为 2 3%和 1 3%。3 4 小结用戊二醛交联的啤酒废酵母菌体机械强度高，溶胀性小，性质稳定，具有较低的非特异性吸附。实验测得交联菌上的染料固载量为 161 1 mg/g，吸附剂比表面积大，对溶菌酶的饱和吸附量为229 1 mg / g，且在吸附过程中溶菌酶的活性保持完好。从鸡蛋清中提取溶菌酶的活力收得率较高，纯化效果显著。与商品化的染料亲和吸附剂相比，在机械稳定性、染料固载量和蛋白吸附容量等方面均具有一定的优势。93第 1 期 陈 聪等: 辛巴蓝 F-3GA 修饰的啤酒废酵母菌亲和吸附溶菌酶References1 LI Lin，DENG Ji-Xian，LU Jian-Shen( 李 琳，邓继先，卢建申) Bulletin of the Academy of Military Medical Scienc
