一黄柏中小檗碱的提取分离和鉴别

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1、天然药物化学实验讲义重庆医科大学药学院目录一、黄柏中生物碱的提取、分离和鉴别二、槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别三、穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别四、八角茴香挥发油的提取及鉴别五、大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别六、苦参生物碱的提取、分离与鉴别天然药物化学实验是一门实践性很强的课程，理论教学与实验教学 是一个不可分割的完整体系。通过实验课的学习使学生能印证并加深理解课 堂讲授的理论知识，掌握由天然药物中提取、分离、精制有效成分，并对其 进行鉴别的基本方法和技能，提高学生独立动手、观察分析、解决问题的能 力，培养学生严谨的科学态度和良好的科研作风。实验一 黄柏中小檗碱的提取、分离和鉴别

2、【实验目的】1. 掌握从黄柏中提取小檗碱的原理和方法。2. 掌握小檗碱的理化性质和鉴别方法3熟TLC的基本操作以及在中药有效成分提取分离中的应用。实验原理】O性状：黄色结晶，有5.5个结晶水，mpl45C。1. 小檗碱（berberine），含量为1.4%-4%（川黄柏含量较高）OMe溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和熱乙 醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但 较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶， 含2分子结晶水，220C时分解并转变为棕红色小檗红碱，285C

3、时完全熔融。2. 小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。利用 小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，首先用石灰乳沉淀黏液质，用碱水提出小檗碱 再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。【实验仪器与试剂】1.1000、500、100、10ml 烧杯， 10ml 试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗， 洗瓶，布氏漏斗，电炉，10 X 20cm薄层板，10 X 20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯 （仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉。2. 川黄柏粗粉，滤纸， pH 试纸，生石灰， 1%硫酸，浓硫酸，浓盐酸，浓硝酸，次氯酸 钠，10%氢氧化钠，丙酮，乙醇，稀硫酸，锌粒，食

4、盐，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，展开 剂：苯乙酸乙酯异丙醇甲醇水（6:3:1.5:1.5:0.3），甲醇，氨水，盐酸小檗碱 对照品。【实验步骤】1提取称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸600mL，搅拌均匀，浸泡过夜，纱布过滤。 或称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸200mL，搅拌均匀，使湿润度合适，放置30min后，装入渗漉筒内，用1%硫酸浸泡过夜，渗漉，速度以56mL/min为宜。收集渗漉液500600mL 即可停止渗漉。2取上项提取液，加入石灰乳调pHll12，静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调 pH23，再加入溶液量10%食盐，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸

5、小檗碱粗品。3精制 将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过， 滤液加浓HCI调pH2左右，静置过夜，滤取结晶，80C以下干燥，得精制盐酸小檗碱。4.盐酸小檗碱的鉴别(1) 取盐酸小檗碱少许，加漂白粉(或次氯酸钠)少许，即显樱红色。(2) 取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸12滴，即显樱红色。(3) 取盐酸小檗碱约0.05g,溶于5mL热水中，加入10%Na0H溶液2mL，显橙色。溶 液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。(4) 取盐酸小檗碱少许，加水 2mL 溶解后，加锌粉少许，再分数次加入浓硫酸数滴， 振摇，每隔10min加一次

6、，观察其黄色是否消退。( 5)薄层色谱鉴别吸附剂：硅胶H-CMC-Na板。展开剂：苯乙酸乙酯异丙醇甲醇水(6:3:1.5:1.5:0.3)，氨蒸气预平衡 10min 后展开。样品液：自制盐酸小檗碱甲醇液(每1mL含0.5mg)。对照品液：盐酸小檗碱对照品甲醇液(每1mL含0.5mg)。显色：置紫外灯(365nm)下检视，显黄色荧光斑点。 结果：记录样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算 Rf 值。【基本操作注意事项】1. 实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者 粘液质较多过滤麻烦。2. 加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中

7、的溶解度。其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。3. 在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水 浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。【思考题】1. 怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？2. 通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。3. 用薄层色谱法检识盐酸小檗碱时，选用氧化铝或硅胶作吸附剂，二者有何区别？展 开剂有何不同？实验二 槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别【实验目的】1. 掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。2. 掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法3.熟悉和了

8、解采收与炮制对芦丁含量的影响。【实验原理】1.槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花莆。前者习称槐花FlosSphorae；后者习称槐米Flos Sophorae Immaturus。主产于河北、山东、河南、陕西、江 苏、广东、广西、辽宁等地。以河北、山东、河南产量大。 性能：苦，性微寒。功效： 凉血止血、清肝泻火 。应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、 头痛眩晕等。劇皮素 R-H2. 主要含有芦丁（芸香苷）、槲皮素，还含少量皂苷类 及多糖、粘液质等。近代研究表明槐米含芦丁可高达23.5%， 槐花开放后降至13.0%。芦丁可用于治疗毛细血管脆性引

9、起的 出血症，并用作高血压辅助治疗剂。芦丁还可以作为制备槲 皮素、羟乙基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的 原料。3芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C H O3H 0）,27 30 162加热至185C以上熔融并开始分解。芦丁的溶解度，在冷水中1:10000,沸水中1:200,沸 乙醇中 1:60，沸甲醇中 1:7，可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙 酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。【实验仪器与试剂】1.1000、 500、 100、 10ml

10、 烧杯， 10ml 试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗， 洗瓶，布氏漏斗，电炉，10X20cm薄层板，10X20cm薄层色谱缸，色谱专用滤纸，聚酰 胺色谱膜，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小 型空压机。2槐花米粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，硼砂，2%硫酸，浓硫酸，稀盐酸，浓盐酸， 10%氢氧化钠，乙醇，10%a -萘酚乙醇溶液，镁粉，1%醋酸镁甲醇溶液，1%三氯化铝乙醇 溶液，2%二氯氧锆甲醇溶液，2%枸橼酸甲醇溶液，Ba（OH）2,滑石粉，甲醇，氨水，芸香苷、 槲皮素、葡萄糖、鼠李糖对照品，展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱）， 9

11、0%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱），显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂。【实验步骤】1芸香苷的提取 称取50g槐花米粗粉，于500mL烧杯中，加入0.4%硼砂沸水溶液 300mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH89，加热微沸30min，注意添加水，随时补充 蒸发掉的水分保持原体积并维持pH89,趁热用脱脂棉过滤；药渣同样操作再提取一次， 合并滤液，稍冷，用浓盐酸调至pH45，静置过夜使沉淀完全，抽滤，用蒸馏水洗34 次，抽干置空气中自然干燥得淡黄色粗制芸香苷。2芸香苷的精制 将芸香苷粗品置500mL烧杯中，加适量（约100mL）蒸馏水，再用 石灰水调至pH8。加热煮沸数分钟，使充分溶解。趁热

12、抽滤，滤液滴加3mol/LHCl调至pH7, 放置18h以上，即析出沉淀。减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀23次。抽干，于70 80C干燥1h,即得精制芦丁。称重，计算产率。3芸香苷的水解 取精制芦丁 2g,研细，置于500mL圆底烧瓶中，加2%硫酸溶液150mL， 于直火回流30min,放置至室温，析出黄色槲皮素结晶，抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。 沉淀水洗后再用95%乙醇重结晶一次，得黄色针状结晶，于7080C以下干燥，即得精制 槲皮素。4. 检识（1）取芸香苷、槲皮素少许，分别用10mL乙醇溶解，制成试样溶液，照以下方法进 行实验。 Molish反应：取试样溶液各2mL,分置于两支试管中，

13、加10%a -萘酚乙醇溶液1mL, 振摇后倾斜试管45，沿管壁滴加2mL浓硫酸，静置，观察两液面交界处颜色变化（棕色 环）。 盐酸-镁粉反应：取试样溶液各2mL,分别置于两支试管中，各加入镁粉少许，再加 入浓盐酸数滴，观察并记录颜色变化。 醋酸镁反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%醋酸镁甲醇溶液2滴，于 紫外灯下观察荧光变化，并记录。 三氯化铝反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%三氯化铝乙醇溶液2滴, 于紫外灯下观察荧光变化，并记录。 锆-枸橼酸反应：取试样溶液各2mL,分别置于两支试管中，各加2%二氯氧锆甲醇 溶液34滴，观察颜色，然后加入2%枸橼酸甲醇溶液34滴，观察并

14、记录颜色变化。（2）糖的纸色谱鉴定 取水解母液20mL，用Ba（OH）的细粉（约2.6g）中和至pH7,2滤去生成的BaSO沉淀（可用滑石粉助滤），滤液浓缩至约1mL，供纸色谱点样用。4样品：水解浓缩液色谱滤纸：新华滤纸对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液 展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液。显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后105C烘lOmin，显棕红色斑点。苯胺-邻苯二 甲酸的配制：将1.66g苯二甲酸和0.93g的苯胺溶于100mL水饱和的正丁醇中。（3）芦丁、槲皮素的纸色谱和聚酰胺薄层色谱鉴定样品：自制芦丁、槲皮素的乙醇液色谱材料：新华滤纸，聚酰胺薄膜对照品：芦丁、槲皮素的乙醇溶液

15、展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱）。90%乙醇或乙醇-水（7:3） （聚酰胺色谱）。显色： 可见光下观察及紫外灯下观察。 喷三氯化铝试剂后再观察。【基本操作注意事项】1. 加入石灰乳即可达到碱溶解提取芸香苷目的，又能使槐米中含存的大量粘液质生成 钙盐沉淀除去，但应严格控制在pH89,不得超过10。pH过高，在加热提取过程中可促 使芸香苷水解破坏，造成产率明显下降。酸沉时加浓硫酸调pH34,不宜过低，否则会使 芸香苷生成盐溶于水，也会降低收率。2. 加入硼砂的目的是使其与芸香苷邻二酚羟基结合，这样既保护邻二酚羟基不被氧化 破坏，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香苷不受损失。同时还有调节碱性水溶液 PH 值的作用。3. 芸香苷的提取还可以利用芸香苷在冷、热水中的溶解度不同，采用沸水提取法。【思考题】1. 苷类水解有几种催化方法？2. 试解释芸香苷水解过程中出现的混浊一澄清一混浊现象。3. 怎样正确鉴定芸香苷？4. 本实验提取过程中应注意哪些问题？实验三 穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别【实验目的】1. 掌握从穿心莲药材中提取亲脂性成分的原理和方法。2. 掌握除去叶绿素的原理和方法。3. 熟悉内酯类成分的主要理化性质及鉴别方法。 【