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1、微生物检验技术教学资源库微生物检验技术课程实训指导手册项目一 牛乳中金黄色葡萄球菌的定性检验（依据 GB 4789.10-2010 第一法）一、实训目的掌握按照国标进行食品中金黄色葡萄球菌的检验和判定，学会样品的制备和处理方法， 掌握金黄色葡萄球菌定性检验的程序及要点，掌握金黄色葡萄球菌在分离平板上的菌落特征 以及血浆凝固酶试验的操作过程及结果判定，学会按照二级采样方案对金黄色葡萄球菌定性 检验结果进行判定。二、实训原理即一般的检验流程是：增菌-平板分离-鉴定。其中增菌，进行选择性增菌培养，允许金 黄色葡萄球菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖；平板分离，采用可抑制非金黄色 葡萄球菌生长的
2、固体选择性培养基和血平板，提供肉眼可见的疑似金黄色葡萄球菌的纯菌落 和溶血现象；最后通过菌体形态观察、血浆凝固酶试验进行鉴别和判定。三、实训要求本实验项目操作标准依据 GB 4789.10-2010第 一法。本项目全面考察学生对牛乳中沙门氏菌检验项目的实施过程中所涉及样品处理，增菌，平板分离，鉴定等3个环节整体把握和运用能力以及在整个实验过程中的操作文明和操作安全意识。本项目按4人 /组为单位进行操作，要求按照无菌操作完成样品的处理过程，正确配制培养基和试剂，学会样品的接种，液 -液接种，平板划线以及相应的鉴定试验（如染色镜检，血浆凝固酶试验等），掌握金黄色葡 萄球菌在各分离平板上的典型特征和
3、溶血试验现象，学会原始记录的书写以及结果的判定。四、实验材料和设备1. 实验设备金黄色葡萄球菌检验的实验设备有：天平、均质器、超净工作台、生物安全柜、恒温恒湿培养箱、高压灭菌器、显微镜。2. 实验用具金黄色葡萄球菌检验的实验用具有：无菌吸管、微量移液器及吸头、无菌试管、接种环。3. 培养基及试剂金黄色葡萄球菌检验用到的培养基及试剂有：（1）增菌试剂：7.5%氯化钠肉汤。增菌可使用7.5漁化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大 豆肉汤，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，而除某些嗜高盐的 海洋菌外，大多数细菌都能被增菌液中的高盐所抑制。(2) 分离平板：血琼脂平板和 baird-p
4、arker ( BP琼脂平板；其中BP琼脂培养基需按 照95mL的倍数配制，高压灭菌后，冷却至 50C,每95mL加入预热50C的卵黄亚碲酸钾增菌 剂5mL摇匀后倾注平板，培养基应是致密不透明的，使用前在冰箱保存不得超过 48h。(3) 纯化平板：营养琼脂平板或营养琼脂小斜面。本实验采用营养琼脂平板(4) 鉴定试剂：革兰氏染色液、脑心浸出液肉汤(BHI)、冻干兔血浆。4、实验室要求及个人防护用品实验室要求：实验根据GB 4789.1-2010食品安全国家标准 食品微生物检验 总则中要求，一般样 品检验在洁净实验室中进行，病原微生物分离鉴定在二级生物安全实验室( BSL-2)中进行。 该实训要求
5、，样品处理与增菌在无菌室中进行，分离鉴定在 BSL-2实验室中进行。无菌室个人防护用品有：无菌工作服、一次性口罩、帽子和无粉乳胶手套。BSL-2实验室个人防护用品有：防渗透工作服，一次性口罩(有条件者备N95 口罩)、帽子、无粉乳胶手套及聚氯乙烯手套各 1畐叽五、实训任务1、无菌室消毒和准备前增菌需在洁净区域中进行，无菌室的消毒和准备如下： 进入无菌室缓冲间，将样品和增菌液放入传递窗中，打开传递窗紫外灯进行表面杀菌。 进入已进行整体消毒过的无菌室，用75%酒精棉擦拭工作台面，将消毒水废液缸等常 用物品放置在台面上。开启无菌室的紫外灯，辐照灭菌 30min后，关闭无菌室和传递窗的紫 外灯。 进入
6、无菌室缓冲间，更换无菌工作服，戴一次性帽子、口罩和无菌手套，穿上鞋套， 用75%酒精棉彻底消毒双手，取出传递窗内的物品，放在工作台面上，进行后续操作。2、样品处理与增菌在已进行消毒的无菌室内，以75%酒精擦拭样品外包装，尤其是包装的开口处，用无菌 剪刀在样品封口处剪开包装袋，打开盛有 225mL7.5%氯化钠肉汤的样品瓶，用量程为 10mL 的无菌吸管量取25mL牛奶样品至样品瓶中，充分振摇混匀。若样品为固态，需用拍击式均质器拍击2 min。处理完毕的样品通过传递窗出无菌室，清 理无菌室，打开紫外灯，辐照灭菌 30 min。将上述处理好的检测样品放于预先设置 36 C C的恒温恒湿培养箱中培养
7、18h24h。3、平板分离(1) BSL-2实验室消毒与准备病原微生物分离鉴定工作应在 BSL-2实验室中进行，BSL-2实验室的消毒与准备如下： 进入BSL-2实验室缓冲间，做好个人防护，将增菌所用无菌试剂放入BSL-2缓冲间的传递窗中，打开传递窗紫外灯进行表面杀菌。 进入已进行整体消毒过的BSL-2实验室，用75%酒精棉擦拭生物安全柜台面，依次开 启生物安全柜和BSL-2实验室的紫外灯，辐照灭菌1小时后关闭。 进入BSL-2实验室缓冲间，更换防渗透防护衣，戴一次性帽子、口罩和无菌手套，穿 上鞋套，取出传递窗内的物品，放在工作台面上。进行后续操作。注意：操作时避免双臂频 繁穿过气幕破坏气流。
8、(2) 平板分离金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大 豆肉汤内呈混浊生长。在已进行消毒的生物安全柜内用接种环取培养后的7.5%氯化钠肉汤，分别划线接种到BP平板和血平板，于36 C培养箱中培养18h24h，BP平板有时需要延 长至45h48h。本实验中各分离平板上的菌落特征如下：BP平板：菌落直径为2 mm3 mm,颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带， 在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解 的类似菌落；但无混浊带及透明圈。BP培养基中含有卵黄、氯化锂和亚碲酸钾，能抑制大多 数细菌的繁殖，而丙酮酸
9、钠和甘氨酸能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。长 期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并 干燥。血平板：菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全 透明溶血圈。金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，这是鉴 定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。4、鉴定(1)染色镜检取洁净载玻片，于其上滴加1滴生理盐水，用接种环将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直 径约为 0.5 yrml(2)血浆凝固酶试验挑取BP平板或血平板上可疑菌落
10、1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂平板， 36C培养箱中培养18 h24 h。取BHI培养物0.20.3 mL加入到已用0.5 mL无菌生理 盐水完全溶解的冻干兔血浆安瓿瓶中，振荡摇匀，加入0.5 mL无菌生理盐水至完全溶解，再加入BHI培养物0.2 mL0.3 mL,振荡摇匀， 置36C培养箱中培养，每半小时观察一次，共观察6 h，如兔血浆呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，则判定为阳性结果。由于病原性葡 萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成 凝块。凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。注意：测试
11、时须同时以血浆凝固酶试 验阳性和阴性葡萄球菌菌株的新鲜肉汤培养物作为对照，建议阳性菌株可选择金黄色葡萄球 菌标准菌株ATCC6538，阴性菌株可选择表皮葡萄球菌或白色葡萄球菌标准菌株。本实验金黄色葡萄球菌标准菌株和待检菌均为凝固，表皮葡萄球菌不凝固，判定该待检 菌为阳性。结果如可疑，可再挑取营养琼脂平板的菌落到5 mL BHI ,36C培养18 h48 h，重复本试验以进行确认。5、金黄色葡萄球菌肠毒素检验金黄色葡萄球菌肠毒素是一种重要的致病物质，是引起的食物中毒的重要原因。近年报 导显示，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。可疑
12、食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌 株的鉴定，可按标准附录B进行葡萄球菌肠毒素检验。6、结果与报告染色镜检和血浆凝固酶特征符合金黄色葡萄球菌特征的，可判定为金黄色葡萄球菌。结 果报告为：在25 g ( mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。本实验在血平板和BP平板上的菌落形态典型，经染色镜检为革兰氏阳性球菌，呈葡萄 串状排列，血浆凝固酶阳性，可判定为检出金黄色葡萄球菌，结果报告为25mL样品中检出。填写原始记录单和报告。根据GB4789.1-2010食品安全国家标准 食品微生物检验 总则要求检验后样品要进 行无害化处理。#微生物检验技术教学资源库#六、原始数据记录表金黄色葡萄
13、球菌检验原始记录样品编号样品名称样品状态固态，无异常 液态，无异常 其他：样品数量温度C湿度检验方法检测地点主要检测仪器 名称及编号分析前设备状态正常异常分析后设备状态正常异常主要培养基和试剂检验项目测试数据记录检验结果技术指标检验结论金黄色葡萄 球菌检样 25g(ml) + 225 ml7.5% 氯 化钠肉汤(361C, 1824h)培养结果血平板(36 1 C, 1824h)培养结果Baird-parker 平板(36 1 C, 1824h)培养结果革兰氏染色结 果和菌落形态 25g (mL)样品中未检出 25g (mL)样品中检岀n=5c= m=M=符合不符合颜色清澈混浊生长无可疑菌落生长有可疑菌落生长无可疑菌落生长有可疑菌落生长 - +形态：BHI (36 C, 1824h)培养结果血浆凝固酶试验结果营养琼脂斜面培养 后的血浆凝固酶实验颜色清澈混浊生长 - + - +备注“ + ”为阴性，“-”为阳性复核人员/日期:检验人员/日期:培养基(试剂)配制记录日期:生产商:名称类型批号用量(g)体积(ml)初、始PH值火菌措施(温度、时间)评估情况备注复核人/日期:配制人/日期:
