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1、2方法与结果24 2. 1超声提取法正交试验、验证和提取方法超声波提取方法 称取三七粗粉 20 g ,经 正交选择,用 75%的乙醇超声提取 3 次,每次 2 h 。 提取后回收乙醇,剩余提取液用蒸馏水稀释,使提取 液中乙醇含量不超过 0. 5%,再用中 空纤维膜过滤 器进行超滤,获取 2 000 分子量以下的超滤液( 三七 皂苷的分子量在 2 000 以下) ,浓缩,上 D 101大孔吸 附树脂柱,用水洗至流出液无色,改用 75%的乙醇 洗脱,收集 75% 的乙醇洗脱液 6, 7 ,减压浓缩,真空 干燥得三七总提取物( 测总皂苷、人参皂苷 Rb 1、 Rg 1 的含量)水煎煮方法 称取三七粗
2、粉 20 g ,选择煎煮 时间、用水倍量、煎煮次数三因素,应用 L 9( 33) 正交 试验表实施方案,优选出最佳提取工艺: 10倍量的 水煎煮 2 次,每次 1 h 。水提取液用 中空纤维膜过滤 器进行超滤,以下按 2. 1. 3 项获取 2 000分子量以 下的超滤液开始同法操 作。乙醇回流提取方法 称取三七粗粉 20 g ,选择 回流时间、乙醇浓度、回流提取次数三因素, 应用 L 9 ( 33) 正交试验表实施方案,优选出最佳提取工艺: 75%的乙醇回流提取 2 次,每次 1 h 。提取后回收乙 醇,剩余提取液用蒸馏水稀释,使乙醇含量不超过 0. 5%, 再用中空纤维膜 过滤器进行超滤,
3、以下按 2. 1. 3项获取 2 000分子量以下的超滤液开始同法 操作。提取工艺的得率比较用上述三种提取方法, 即水煎煮法、乙醇回流法、超声提取法三法的最佳工艺提取。 三七有效成分不同提取方法结果比较提取方法三七总皂苷提取率(%)占总皂苷含量(%) 人参皂苷 Rg 1 人参皂苷 Rb 1 权重值 水煎煮法 83. 29 10. 74 44. 12 88. 3乙醇回流法 80. 07 14. 08 55. 18 89. 47超声提取法 101. 12 16. 43 59. 59 97. 243 含量测定 3. 1 三七总皂苷的含量测定 3. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取三七总皂 苷 对
4、照品 5 mg ,用无水乙醇定容至 50 mL 容量瓶中, 做对照品溶液。 3. 1. 2 供试品溶液 的制备9 称取样品适量，用无水乙醇定容在10 mL容量瓶中，用0. 45 p m滤膜过滤，弃 去初滤液,选择续滤液。3. 1. 3 线性关系考察 精密称取对照品溶液 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、 2. 0、 4. 0 p L ,分别注入具 塞试管中,去塞,水浴蒸去乙醇,每只试管分别精 密加入新配 制的5%香草醛冰醋酸溶液0. 2 mL,高氯酸0. 8 mL,摇匀，置60 C水浴中加热15 mi n , 取出，用冷水迅速冷却,加冰醋酸溶液5 mL，摇匀，在560 nm处测
5、吸收度A,以吸收度A为纵 坐标(Y),浓度C为横坐标(X),绘制标准曲线，得回归 方程,Y=0. 013 66X+0. 007 4, r=0. 999 0, 结果 表明,三七总皂苷在 3. 3 66. 67 p g /mL 内线性关 系良好。 3. 1. 4 稳定性试验 取供试品溶液 0. 1 mL ,按 3. 1. 3 项中从加 5%香草醛冰醋酸比色法显色后 操作,在 560 n m 处每隔一段时间测定吸收度 A ,在 显色 10 mi n 后 A 趋于稳定,时间约为 1 h 内无变 化,因 此采用5%香草醛冰醋酸比色法显色，测定时间应在1 h内完成。结果:1 h内稳定，与文献报 道一致。3
6、. 1. 5 回收率试验 取已知总皂苷含量的样品 9 份,精密称定,分别准确加入 1. 21. 5、 1. 8 mL 对照 品溶液( 0. 585 mg /mL) ,照 3. 1. 3 项下方法作加样 回收试验, 分 别测定 其含量, 得 平均回 收率为 99. 18%, RS D=0. 92%。 3. 2 人参皂苷 Rg 1 的测定 3. 2. 1 色 谱条件 色谱柱:Ag i l e n tT c -C 18 ( 5 p m , 4. 6 mm X 250 mm);检测器为紫外检测器；流动 相：乙腈-水(40：0);流速:0. 6 mL /mi n ;检测波长:203 n m;柱温：室温；
7、进样量:20 p L。3. 2. 2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷 Rg 1 标准品 9. 01 mg ,用水定容至 100 mL 容量瓶中, 作为对照品溶液。 3. 2. 3 供试品溶液的制备 精密称取三七提取 物 4. 13 mg ,用水定容至 10 mL 容量瓶中,用 0. 45p m 滤膜过滤,弃去初滤液,备用续滤液,作为供试 品溶液。 3. 2. 4 线性关系考察 取对照 品溶液适量, 用 0. 45 p m 的微孔滤膜过滤分别量取 2、4、8、12、16、 20 mL ,置 25 mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，取20 p L进样,以浓度C为横坐标(X)，峰面积值为
8、纵 坐标(Y)进行线性回归，得回归方程为Y =5 516. 018 9X+28 804. 693 2, r=0. 999 9,结果 表明， 人参皂苷Rg 1在0. 180 21. 802 mg范围内线性关系良好。3. 2. 5精密度试验 取 3. 2. 2 项下溶液于测定 条件下进样 20 p L ,重复进样 6 次,色谱峰 RS D= 1. 64%。 3. 2. 6 稳定性试验 取 3. 2. 3 项下溶液分别于 0、 2、4、6、8、12、24 h ,进样 20 p L ,色谱峰的 RS D 为 1. 54%,表明样品在 24 h 内稳定。 3. 2. 7 重现性试验 取 5 份三七总皂苷
9、粗品,按 3. 2. 3项供试品溶液的制备方法制备，分别依法测定，得RS D为1. 66%，表明本试验重现性良 好。 3. 2. 8 回收率试验 称取同一已知含量样品 9 份, 分 3 组,每组分别准确加入 1. 2、 1. 5、1. 8 mL 对照品 溶液( 0. 554 mg /mL) ,按 3. 2. 4 项下方法制备加样 回收试 样, 分别 测 定其含 量, 得平 均回收率 为 98. 6%, RSD=1. 34%。 3. 3 人参皂苷 Rb 1 的含量测定 3. 3. 1色谱条件 色谱柱:Ag i l e n tTc C 18( 5 p m , 4. 6 mm X250 mm);检测
10、器为紫外检测器; 流动相: 乙腈-水( 40：60); 流速: 0. 6 mL /mi n; 检测波长: 203 n m; 柱温: 室温; 进样量: 20 p L 。 3. 3. 2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷 Rb 1 标准品 13. 25 mg ,用水定容于 100 mL 容量瓶 中,作为对照品溶液。 3. 3. 3 供试品溶液的制备 精密称取三七提取 物 3. 16 mg , 用水定容至 10 mL 容量瓶中,用 0. 45 p m 滤膜过滤,弃去初滤液,备用续滤液,作为供 试 品溶液。 3. 3. 4 线性关系考察 取对照品溶液适量用 0. 45 p m 微孔滤膜过滤,分别 量
11、取 2、3、5、7、10 mL ,置 25 mL 容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,取 20 p L 进样,以浓度 C 为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程为Y= 274 461. 77X-146 545. 33, r=0. 999 8, 结果 表 明,人参皂苷 Rb 1 在 1. 06 5. 31 p g 范围内线性 关 系良好。 3. 3. 5 精密度试验 精密称取 3. 3. 2 项下的对照 品溶液,重复进样 6 次,色谱 峰的 RSD 为 1. 43%。207 药 学实践杂志 2009 年第 27 卷第 3 期3. 3. 6 稳定性试验 取 3. 3. 3 项下供
12、试品溶液,分 别于 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h 进 样, 测 得 RS D 为 1. 21%,表明样品在 24 h 内稳定。 3. 3. 7 重现性试验 用同种方法 提取 5 份三七总 皂苷粗品,按 3. 3. 3 项供试品溶液的制备方法制备, 分别依法测定,得 RS D= 0. 48%,说明本试验重现性 良好。 3. 3. 8 回收率试验 称取同一已知含量样品 9 份, 分 三组,每组分别准确加入 1. 2、1. 5、1. 8 mL 对照品 溶液( 0. 598 mg /mL) ,按 3. 3. 4 项下方法 制备加样 回收试样, 分 别测定 其含量, 得 平均回 收率为
13、 99. 3%, RS D=1. 06%。 4 讨论4. 1 将样品上大孔吸附树脂后,以水洗脱至无色澄 清,先后用 30%、50%、70%、95%的乙醇 洗脱,并分 别收集洗脱液,制成供试品溶液,发现 75%乙醇的 洗脱液色谱峰的强度最大, 故 选择水洗后, 再用 75%的乙醇洗脱。 4. 2 三七总皂苷的含量采用分光光度法进行测定 时, 应注意控制加热温度和加热时间，当温度高于60 C长时间加热时，糖类吸收干扰显著，总皂 苷的测定以60 C,加热15 mi n为宜，三七总皂苷显色在1 h内稳定，故显色后均要求1 h 内测定。4. 3本研究认为超声提取法最好:方法简捷，只需6 h即可完成全部提取过程。提取率 高,总皂 苷提取率可达到 99%以上,杂质减少,剂量减小,使 用提取物体积最小,故本试验方法 的提取物适于做 现代制剂如缓释片、速崩片等
