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1、p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究【摘要】 目的：探讨慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织p38MAPK的表达变化,进而分析p38MAPK在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将12只雌性(C57BL/6JDBA/2)F1杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组6只。于16周末处死，取肾行HE和Masson染色，应用免疫组化方法检测TGF-1、p38MAPK、P-p38MAPK在肾脏的定位表达，RT-PCR法研究各组肾组织TGF-1、p38MAPK mRNA的表达,Western blot定量检测TGF-1、p38MAPK、P-p38MAPK蛋白的表达水平，并观察两组小鼠
2、24h尿蛋白排泄量。结果：与正常对照组比较,模型组小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-1、p38MAPK和 P-p38MAPK蛋白及mRNA表达均明显增加(P),TGF-1与p38MAPK的表达呈正相关(r=,P)。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中TGF-1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表达明显上调,p38MAPK信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。【关键词】 慢性移植物抗宿主病； 狼疮肾炎； p38MAPK； 小鼠 狼疮肾炎是系统性红斑狼疮最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾
3、脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，在其发展过程中，多种因素发挥着重要作用,其中TGF-1起着关键作用。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 级联是细胞内重要的信号转导系统,它参与胞外信号从表面转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来许多研究结果表明，其亚族p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为信号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用，但在LN肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗宿主病(chronic graf
4、t versus host disease,cGVHD)狼疮样小鼠模型,探讨作为TGF-1下游信号介质，p38MAPK在LN发展过程中的表达与活化及其可能的作用机制。 1 材料与方法 实验动物 810周龄雌性(C57BL/6JDBA/2)F1杂交鼠 (以下称杂交鼠)及67周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心,体重()g,SPF级，饲养于本校公共卫生学院SPF动物房。 模型的建立与分组 1制作cGVHD狼疮样小鼠模型。按随机、对照设计原则将12只杂交鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞,制成单细胞悬液(约60%脾细胞、30%胸腺及10%淋巴结细胞),分
5、别于0、3、7、10d经尾静脉注射于模型组杂交鼠,用台盼蓝染色和细胞计数板计数,保证活细胞数大于95%,且每次给予细胞数为50106个。正常对照组则于相应时间经尾静脉注射等体积生理盐水。两组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取1次24h尿,至16周处死动物，立即取下肾脏,一部分置于-70低温保存,另一部分置于10%中性福尔马林溶液中固定后行组织病理学检查。 24h尿蛋白量测定 用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液15稀释后按操作说明书操作。 RT-PCR总RNA提取 从-70低温冰箱中取出肾组织,迅速用Trizol(晶美生物技术有限公司)匀浆提取总RNA。取5l总RNA进行甲醛变性凝胶电泳,紫外灯下观
6、察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。逆转录 逆转录反应体系如下:在PCR管中加入10逆转录缓冲液1l,MgCl2(25mmolL-1)2l,Oligo dT 1l,dNTPs(10mmolL-1)2l,RNase inhibitor l,AMV逆转录酶(TaKaRa公司)1l,总RNA l,30 10min后42逆转录50 min,99灭活逆转录酶5 min,5 5 min,所得cDNA保存于-20用于PCR扩增。PCR扩增 TGF-1、p38MAPK及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK上游引物5-tcgagaccg
7、tttcagtccat-3,下游引物5-ccacggaccaaatatccact-3,产物为463bp；TGF-1上游引物5-tgcttcagctccacagagaa-3,下游引物5-cttgcgacccacgtagtaga-3,产物为267bp；GAPDH上游引物5-acttgaagggtggagccaaa-3,下游引物5-ccaggaaatgagcttgaca-3,产物为608bp。反应体系:5PCR缓冲液10l,MgCl2 4l,dNTPs 1l,上下游引物各1l,cDNA模板1l,TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)l,补足双蒸水至50l。Eppendorf AG 22331 PCR
8、扩增仪扩增,p38MAPK条件为:94预变性3min；94变性30s,54退火40s,72延伸1min,循环36次；72终末延伸10min。TGF-1改退火温度为56，其余与p38MAPK相同。产物检测 扩增产物在含L-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以45Vcm-1电压降电泳30min。于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有TGF-1、p38MAPK扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准校正,以TGF-1/GAPDH、p38MAPK/GAPDH表示。病理检查 2m连续切片,置多聚赖氨酸包被的载玻片上,分别作HE和Masson染
9、色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。 免疫组化检测 SABC法免疫组化染色(试剂盒购自晶美生物技术有限公司)：取2m厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液,室温下孵育10 min；滴加胃蛋白酶修复抗原,37 孵育15 min;加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30 min；滴加兔抗小鼠P-p38MAPK单克隆抗体(1100,Cell Signaling Technology公司),或兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗体(1100,Cell Signaling Technology公司)，或兔抗小鼠TGF-1多克隆抗体(1100,Santa Cruz公司)，4 孵育过夜,37 复温30 m
10、in；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体,37 孵育30 min；加HRP标记的链亲和素,37 孵育30 min；DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片。阴性对照：以PBS替代一抗。 Western blot 取-70 保存的肾皮质约100 mg,加入预冷的蛋白裂解液 ml充分裂解。4 3 000 rmin-1离心10 min取上清。测定蛋白质含量，取100 g蛋白加入上样缓冲液,煮沸3 min后进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转PVDF膜,TTBS封闭液37 封闭2 h,分别与兔抗小鼠TGF-1多克隆抗体、兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗体和兔抗小鼠P-p38MAPK单克隆抗体,4 过夜,
11、加入12500稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗,37 ,2 h，DAB显色。每组重复3次。Western blot条带信号强度应用Kodak 1D图像分析软件进行定量分析。目的条带的相对含量=V目的条带/V对照组。对照组的相对含量为，为表达阳性。 统计学处理 计数资料以x-s表示,采用SPSS 统计软件进行方差分析、t检验，相关性采用Spearman法分析，P为差异有统计学意义。 2 结 果 24 h尿蛋白量测定结果 模型组小鼠24 h尿蛋白总量为mg，显着高于相应正常对照组小鼠的mg，P。 肾组织p38MAPK mRNA、TGF-1 mRNA半定量结果 RT-PCR检测结果见图1。
12、模型组小鼠肾组织p38MAPK、TGF-1 mRNA表达分别与相应正常对照组比较差异有统计学意义(P)，见表1。表1 两组小鼠肾组织p38MAPK、TGF-1 mRNA表达的半定量分析 1)与正常对照组比较，P 肾组织HE、Masson染色结果 正常对照组小鼠肾小球、近端小管及远端小管的大小、形态正常。模型组小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,系膜区增宽，大量基质沉积,可见部分肾小球呈现萎缩硬化改变;肾小管呈多灶性萎缩及空泡变性,上皮细胞胞核脱落、坏死,管腔内可见大量蛋白管型，肾间质基质沉积明显。 免疫组化结果肾组织中TGF-1表达变化 正常对照组小鼠仅在少数肾小管有微弱TGF-1表达
13、,而模型组小鼠肾小球细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质浸润的单核细胞胞浆均有TGF-1明显表达，染色细胞数明显增多，细胞染色程度加深。见图2。肾组织中p38MAPK表达变化 正常对照组小鼠肾脏远端肾小管、近端肾小管及集合管上皮细胞均有少量p38MAPK表达；模型组小鼠肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、肾小管间质中阳性细胞数显着增加，阳性表达颜色加深。见图3。肾组织中P-p38MAPK表达变化 正常对照组小鼠仅肾小管间质有极少量的P-p38MAPK表达；模型组小鼠肾组织P-p38MAPK主要表达在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、近端和远端肾小管及集合管上皮细胞。见图4。West
14、ern blot检测结果 Western blot检测结果见图5。模型组小鼠肾组织TGF-1、p38MAPK 、P-p38MAPK蛋白表达较正常对照组小鼠明显升高，差异有统计学意义(P)，见表2。表2 两组小鼠肾组织p38MAPK、TGF-1和P-p38MAPK蛋白表达的定量分析 肾组织TGF-1、p38MAPK和P-p38MAPK 相关分析 实验小鼠肾组织p38MAPK 表达与TGF-1 表达呈正相关(r=,P)，P-p38MAPK 表达与TGF-1表达呈正相关(r=,P)，P-p38MAPK 表达与p38MAPK 表达呈正相关(r=,P) 。 3 讨 论 肾脏纤维化是几乎所有肾脏疾病发展到
15、终末期肾功能衰竭的共同通路,包括LN在内许多进展性肾脏疾病均具有TGF-1持续过度表达的特征。TGF-1是公认的肾脏致纤维化因子之一,而MAPK通路是细胞内TGF-1信号通路的重要成分。其亚型p38MAPK是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一,其信号转导途径是近年来细胞生物学研究的热点之一。p38MAPK信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信号:细胞外刺激激活MKKK(MAP kinase kinase kinase),转而激活MKK(MAP kinase kinase),然后通过双位点磷酸化成为磷酸化p38MAPK而激活MAPK 信号转导通路,参与应激条件下细胞的凋亡、免疫调节、细胞转分化及炎症反应过程2。Meyer-Ter-Vehn等3研究表明，TGF-1通过活化p38MAPK诱导人成纤维细胞胶原的合成，纤维连接蛋白(FN)、-SMA的表达及细胞增殖,p38MAPK特异性抑制剂能抑制上述表达，说明p38MAPK在TGF-1诱导的肌成纤维细胞转分化及细胞外基质合成中发挥重要作用。Stambe等4研究单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化动物模型中p38MAPK信号通路的作用时显示，磷酸化p38MAPK在UUO大鼠肾间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞均明显增加，而以特定p38MAPK阻断剂NPC31169处理UUO大
