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1、2023单细胞RNA测序在糖尿病治疗中的应用(全文)摘要单细胞RNA测序技术(SinglecellRNAsequencing,SCRNA-Seq)从单个细胞水平分析细胞转录组，能够发现细胞中基因突变引起的差异表达。基于胰岛的发育图谱和异质性特征描绘是目前scRNA-seq在糖尿病中的主要应用；还可用于标记和纯化胰岛成体干细胞中功能性B细胞，有望改善1型糖尿病患者细胞移植成功率,该技术帮助研究糖尿病细胞去分化和免疫调节，应用于糖尿病治疗。同时，scRNA-seq在糖尿病性视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病动脉粥样硬化和糖尿病周围神经病变中运用已经起步，即将迎来多样化的使用场景和广阔的应用前景。单细胞
2、RNA测序技术(Single-CeIlRNAsequencing,SCRNA-Seq)作为最近几年生物医学技术领域革命性发展的经典例子1在2018年被科学杂志评选为年度十大科学突破2,极大程度推动了精准医学和个性化治疗的发展，也是拆解糖尿病复杂性和异质性难题的重要研究工具。然而，由于该技术的高准入门槛和高昂的成本，它的应用一直被限制在一个狭窄的圈子里。最近23年，越来越多的商业化单细胞测序平台陆续走向市场，激烈的市场竞争带来各种技术创新、技术瓶颈的突破以及成本的大幅度降低3,4,5,尤其是在新型冠状病毒感染大流行之后，scRNA-seq被广泛用于研究免疫细胞对新型冠状病毒的反应。糖尿病是在遗传
3、易感因素基础上由环境因素共同催生形成的一种复杂性和异质性疾病。糖尿病往往累及心脑血管、肝脏、肌肉和脂肪等多脏器的代谢性损伤，最终衍生出各种慢性致命性并发症。在糖尿病研究领域，scRNA-seq技术的应用相对来说还十分稀缺，目前主要集中在描绘胰岛细胞的不同分型和异质性特征，分析胰岛细胞的分化成熟过程和特征性标记物，研究糖尿病B细胞去分化和免疫调节，以及在糖尿病性视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病动脉粥样硬化和糖尿病周围神经病变中的少量应用案例。本文主要阐述scRNA-seq技术在糖尿病中的应用,该技术有望从基础研究向临床应用发展，指导糖尿病的诊断及精准治疗。一、SCRNA-Seq技术1 .scRNA
4、-seq概述：单细胞测序技术是将通过分离实验得到的单个细胞，对基因组、转录组或表观组进行的高通量测序技术，从而获得单个细胞的遗传信息和基因表达的信息。过程主要分为单细胞分离、对所得单细胞全基因组扩增、高通量测序1,2。从测序对象的角度可分为单细胞基因组测序、单细胞转录组测序、单细胞表观组测序以及单细胞多组学测序7等。此外，单细胞多组学测序还可以和蛋白质组学、代谢组学等进行联合分析。常用的单细胞捕获方法主要有：有限稀释法、单细胞显微操作、流式细胞仪分选、激光捕获显微切割、蜂窝板技术和液滴微流控技术等8。在过去的10年里，单细胞转录组学取得了巨大的技术突破。scRNA-seq又被称为单细胞转录组测
5、序，通过scRNA-seq,可以在单个研究中分析数百万细胞的单细胞转录水平，从而能够在转录水平上对每个细胞进行分类，识别出具有重要功能的稀有细胞群。scRNA-seq的程序主要包括单细胞分离和捕获、细胞裂解、逆转录、CDNA扩增和文库制备，与传统转录组测序分析技术相比，其差异分辨率明显提高。单细胞捕获、逆转录和CDNA扩增是文库制备步骤中最具挑战性的部分。单细胞分离和捕获是指从组织中获取高质量的单个细胞，然后提取细胞中的遗传和生化信息，促进遗传和分子机制的研究9。传统的转录组只能捕获组织信号的总体水平，无法区分单个细胞的变异。根据生物体、组织或细胞特性的不同，单细胞分离和捕获方法也不同，细胞分
6、离可以通过分离整个细胞、细胞特异性细胞核或细胞特异性细胞器来完成，甚至可以通过分离表达特定标记蛋白的所需细胞来完成口0o最常见的单细胞分离和捕获技术包括限制稀释、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选、微流体系统和激光显微解剖。2 .scRNA-seq应用及平台：目前scRNA-seq有3个广泛应用的分支：单细胞免疫组库测序、空间转录组测序以及单细胞核转录组测序(SnRNA-seq)。单细胞免疫组库测序又称单细胞V(D)J测序,是以T/B淋巴细胞为研究目标,扩增T/B细胞受体(TCR/BCR)的基因转录子全序列后进行高通量测序11。空间转录组测序是将基因表达情况与组织切片定位染色图像进行
7、整合，从而将组织内细胞的基因表达信息定位到组织的原始空间位置上,直接观测组织中不同部位功能区基因表达的差异12。SnRNA-Seq是指通过提取、分离、笔记样本单细胞核，在单细胞水平研究核基因表达的检测技术，是解决细胞类型少以及珍贵临床冰冻样本的重要方法。随着生命科学研究进入了单细胞生物学时代，商业化的scRNA-seq平台应运而生，单细胞测序技术的市场更是以年均20%以上的速度逐年增长。其中包括基于微流控芯片技术的FluidigmC1平台和ICELL8平台，起源自Drop-Seq技术的IOXGenOmiCS平台，源于Cyto-seq蜂窝板技术的BDRh叩SOdy平台，基于组合标签法的ICB-S
8、CSeq平台等等口3,14。以目前占全球95%市场份额的IoXGenOmiCS平台为例，由于这种单细胞检测平台的商业化推广和运作，使得单细胞测序技术的使用门槛大大降低,不仅实现了细胞通量的飞跃，而且大幅降低了单个细胞的检测成本15。二、scRNA-seq在糖尿病研究中的应用1.scRNA-seq在描绘胰岛图谱中的应用：胰岛细胞的异质性阻碍了对控制胰岛功能的每种胰岛细胞类型的精确理解，了解胰岛细胞的构成和功能,尤其是含量较少的讲口榭胞,以及其他罕见胰腺细胞的功能，可能是理解糖尿病病理生理学的关键16。美国杰克森实验室利用scRNA-seq技术解析了构成胰岛的细胞种类17,利用基于标记基因表达的细
9、胞分类方法从2型糖尿病(T2DM)患者和正常健康对照人群的胰岛中鉴定出617个有效的单细胞(63%),包含了239个(GCG)细胞,264个(INS)细胞，25个(SST)细胞和18个PP(PPY)细胞J个罕见的E(GHRL)细胞，另外还有19个星状(COLlAl)细胞，24个腺泡(PRSSl)细胞和27个导管(KRTI9)细胞，可能来自胰岛细胞制剂的外分泌污染，以及21个细胞不表达任何特定标记基因。每种细胞类型的比例符合先前报道的范围18。胰岛细胞的scRNA-seq表明，胰腺导管细胞可被作为成体Ngn3+细胞的来源,导管细胞可以通过Ngn3表达成为内分泌细胞。Ngn3是胰腺内分泌祖细胞发育
10、时表达的关键转录因子，与成人细胞新生发育密切相关，表达Ngn3的导管细胞是糖尿病成体细胞新生的来源，可支持B细胞再生。利用这种生理细胞来源，可有益于糖尿病患者的治疗19o该研究还揭示了幽3胞富集多种特异性表达受体(LEPR、GHSRxERBB4、DRD2),这些受体接收并协调来自瘦素、胃饥饿素和多巴胺通路的系统信号，提示驿胞是这些中央及外周代谢信号进入胰岛的集中调节器。8田胞还表达一种基因BCHE,乙酰胆碱和生长素释放肽能够被BCHE基因编码的酶所降解，可局部抑制胰岛的内分泌信号，从而影响胰岛素的分泌20。此外，该研究还在上田胞和榭胞鉴定到了一些以前被认为仅在细胞或者谣胞中表达的基因，如%田胞
11、中的先天性高胰岛素血症基因HADH21和搦胞中的胰岛素富集转录因子ARX转录因子22。HADH基因编码的关键酶短链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶在脂肪酸调节胰岛素分泌中发挥关键作用，HADH是胰岛素分泌的负调节因子，在胰腺B细胞中含量丰富,并抑制谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性，HADH突变导致GDH和高胰岛素血症的激活23。ARX是胰岛素富集转录因子(TFS),其表达的变化与发育状态和糖尿病有关，在胰岛细胞发育和疾病中发挥作用，有研究表明在1型糖尿病中(TlDM)ARX表达下降，这表明该转录因子可能与TlDM中观察到的胰升糖素分泌受损有关24。研究还发现搦胞和5-羟色胺能神经元在基因表达方面存在平行现
12、象,如V田胞表达一种5-羟色胺能转录因子FEV25,转录因子FEV是血清素能回路的调节因子，在血清素能神经元发育和功能中不可或缺，对许多生理状态和行为有广泛的神经调节作用，在发育或成年期，Fev的失活会导致5-羟色胺能神经元的耗竭，影响焦虑、情绪、睡眠和饱腹感26。2.scRNA-seq在胰岛分化和发育中的应用：T1DM的治愈在于细胞的恢复，scRNA-seq技术可以更好解释糖尿病B细胞发育和病理，了解健康和疾病中的细胞异质性。加州大学的研究者利用scRNA-seq技术对出生后1个月内5个不同时间点小鼠的胰岛细胞进行测序分析，得到了转录组的连续动态变化，发现具有分裂能力的未成熟的胰岛佟田胞有S
13、rf/Jun/Fos转录因子的高表达和高度活跃的氨基酸和线粒体代谢特性27,从而揭示了不同增殖状态下单个细胞的特征，以及如何让B细胞进入到分裂状态的机制，为刺激胰岛B细胞的再生提供新的治疗靶点。止匕外，scRNA-seq描述了胰腺发育过程中控制胰腺轿口或田胞生成和成熟的机制，面邛细胞的增殖速率在不同的发育时间达到高峰，而调控发育的通路也在成熟过程中不断丰富。在来自幼体和T2DM供体的胰岛中，scRNA-seq分析出谣胞和细胞均具有不成熟的表达谱，或田胞与间充质细胞保持有限的转录相似性，保留了未成熟状态的特征，在成年期可具有一定程度的细胞可塑性,而佟田胞则获得了完整的佟田胞特异性基因表达程序,以
14、田胞和B细胞可通过抑制非内分泌基因而部分成熟，而不成熟的表达谱可降低外分泌基因的表达，并增加了炎症和应激反应通路的表达28o但是，在不同物种之间面叩细胞有多个基因的差异表达，小鼠的胚胎胰岛细胞大多是单激素的,而大部分人类胰岛细胞最初是多激素的29。因此，可利用人类多能细胞在体外模拟人类胰腺的发育，同时使用scRNA-seq技术分析人类胰岛分化和发育,或可找到糖尿病患者中不同的表达特征。3.scRNA-seq在B细胞移植和胰岛类器官中的应用：T1DM是因人体的免疫系统错误地攻击并破坏了胰腺的细胞引起的，再生医学手段希望通过恢复体内功能性细胞的数量与质量，从而最终取代目前的胰岛素替代疗法。在人类胰
15、岛移植时，可供研究的组织是有限的，与组织分离和单个细胞分离相比，snRNA-seq可快速分离细胞核从而使分离过程中转录组的变化降至最低，为移植研究提供了技术支持30。哈佛大学干细胞研究团队利用scRNA-seq技术分析胰岛中的细胞类型,并且发现了一种仅在B细胞上表达的表面标记物CD49a(ITGA1),并以此特异性地富集细胞,成功将转化干细胞样品中B细胞的分选纯度从30%提高到80%,首次实现了干细胞转化为功能性B细胞，为患者提供了自己的胰岛素来源31。此外，利用SCRNA-Seq技术在小鼠胰岛中发现存在一群以前未被识别的胰腺蛋白C受体阳性(Procr+)细胞群，Procr+细胞是胰岛中的成体
16、干细胞，在体外3D培养体系下可以稳定地形成胰岛类器官，并在成年期产生所有内分泌细胞类型，在功能、形态、超微结构及转录组方面都与真正的小鼠胰岛表现出很大的相似性，能迅速响应葡萄糖刺激，分泌胰岛素，并且能在体外培养传代20代以上。将Procr+细胞群体外培养的胰岛类器官移植到糖尿病小鼠模型体内，可以改善小鼠的血糖水平，逆转糖尿病过程32。单细胞测序分析出的人胰岛细胞成熟和表达过程或可为人类发育中的胰岛细胞成熟分子程序和转录组成熟度丧失提供新的解释，并可推动胰岛细胞的分化发育研究和体外功能性胰岛类器官的研究。4.scRNA-seq在糖尿病去分化诱导治疗的应用：细胞分化不是单向的，在特定条件下，成熟的细胞会在不同程度上失去其分化表型和细胞特性，并退化到分化较低甚至类似前体的状态。有研究表明高血糖诱导的炎症会触发T2DM和T1DM的内分泌细胞去分化33
