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1、 与常规药物分析相比，体内药物分析有哪些特点？体内药物分析（Biopahrmaceutical Analysis）,是一门新兴学科，是药物分析的重要分支，也 是现代药学的创新、延伸和发展。体内药物分析旨在通过各种分析手段，了解药物在体内的 数量与质量变化，获得药物动力学的各种参数、药物在体内的生物转化、代谢方式和途径等 信息。特点：a 干扰杂质多：生物样品中含有的蛋白质、内源性物质和药物的代谢产物都会干扰分析测定 ，样品一般需经过分离、净化才能进行分析。b样品量少（ng/ml ug/ml）,不易重新获得。在测定前需要浓缩、富集。C由于药物浓度低，对分析方法的灵敏度和专属性要求高。d 要求较快提
2、供结果（临床用药监护，中毒解救等）e 要有可以进行复杂样品分析的设备。f 工作量大，测定数据的处理和结果的阐明不太容易。g 有时由于浓度太低，需要测定其缀合物及代谢产物。 影响血药浓度的因素有哪些？ 当药物进入体内后，大多数药物借助血液分布到作用部位或受体部位，当血药浓度达到一定 水平时，才能产生相应的药理效应。 药物进入体内到产生一定的血药浓度，要经过一系列 的过程，包括吸收、分布、代谢、排泄，而这一系列过程会受到多种因素的影响，从而影响 药物在体内的药理效应。1）机体因素a 生理因素（年龄、性别、妇女妊娠等）年龄： 婴幼儿 肝、肾等脏器发育不全，影响吸收、分布、代谢、排泄，药动参数与 成人
3、不同。老年人机体各组织生理功能退化，胃酸分泌减少，血中白蛋白浓度下降，肝 肾血流量减少，药酶活性下降。性别：妇女因激素水平影响生理功能，在药物吸收、蛋白结合率，分布容积及代谢方面与男 性有所不同。2）病理因素 胃、肠道疾病影响吸收，肝脏疾病影响代谢，肾脏疾病影响排泄3）遗传因素（代谢酶活性差异） 酶活性有先天差异，用药个体代谢有快型和慢型之分,如乙酰基转移酶4）药物因素a 剂型因素 药物的粒子大小、晶型、辅料、工艺等影响药物在体内的溶解度。（例地高辛、苯妥英钠） b 手性药物对映体相互作用药效学和药动学相互作用（拮抗或协同作用），在药动学方面的相互作用表现在吸收、分布、 代谢、排泄过程中的竞争
4、性抑制作用和受体对两对映体的选择性作用。5）环境因素a化学物质和合并用药药酶诱导剂、药酶抑制剂、大气污染，烟，酒，茶，食品添加剂等b 人体昼夜节律、营养和精神状态 营养不良对药物作用敏感 精神忧郁对药物反应较重 综上所述，影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以对每一个病人都达到理想的治疗 效果。因此，为做到用药安全、合理、有效，必须设计个体化给药方案，这需要进行“治疗 药物监测(therapeutic drug monitoring, TDM)”，以血药浓度为指标，达到个体化用药。 试述体内药物分析在药学领域中的作用和地位a. 在新药评价和新药开发中的意义 药代动力学和生物利用度研究 随着
5、医药工业的发展，人们已认识到要达到临床安全、有效、合理用药，不仅要从管理、生 产、应用等各环节对药品进行全面质量管理，而且还需进行临床药理学和临床药学的研究， 给新药一个确切的评价。 代谢物研究为设计和发现新药提供信息 部分药物生物转化后的代谢产物较原型药物活性更高，故可利用药物代谢的知识来设计新药 或对原型药物进行结构改造，从而产生新的作用特点的药物。 对药物及其制剂的体内药代动力学研究，也是设计新剂型的基础 要开展以上研究工作，首先要解决的问题是体内微量药物及其代谢物的分离分析方法。b. 在临床合理用药中的意义 药物进入体内后，大多数药物借助血液分不到作用部位或受体部位，当血药浓度达到一定
6、水 平时，才能产生相应的药理效应。临床上的合理用药、个性化给药都与血药浓度的检测密切相关。 常用生物样本有哪些？如何采集、储存。1) 血液 采集：待药物在血液中分布均匀后取样，从静脉采血。制备：血浆(plasma):全血+抗凝剂(肝素等)离心上清液(淡黄色)血清(serum)：全血静置一段时间离心上清液(淡黄色)全血(whole blood):全血+抗凝剂(肝素等)混合储存：采血后即使分离，不超过2h,分离后置于冰箱或冷冻柜中保存；若不予先分离，血 凝后冰冻保存；短期4C,长期-20C。2) 尿液：尿中药物以原型、代谢物或缀合物形式存在。 采集：自然排尿，常用涂蜡的一次性纸杯或玻璃杯 制备：尿
7、液加入适当的防腐剂于储尿瓶储存：主要成分是水、尿素、盐类，易长细菌，短期可置4C冷藏或加防腐剂，若保存时间 长则需冷冻(-20C )保存。3) 唾液采集：漱口 15min后，用插入漏斗的试管收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合 唾液采集时间至少lOmin 制备：唾液除去泡沫部分放置分层离心上清液。储存：4C以下保存冷冻的样品测定时需解冻，最好一次性测定完毕，不要反复冷冻-解冻-冷冻-解冻，以免药 物含量下降。 生物样品测定前为什么要除去蛋白质？除去蛋白质的常用方法有哪些？ 去蛋白质的意义：使结合型药物释放出来，以便测定药物的总浓度；得到较“干净”的提取 液，减少乳化，消除对测定的干扰；
8、保护仪器，延长使用期限。常用的方法：1）蛋白质沉淀法a生成不溶性盐加入酸类（TCA、HC10等）4加入重金属盐（Zn2+、Cu2+、Ag+ ）b盐析和脱水加入中性盐（NH） SO、NaCl）4 2 4加入与水混溶的有机溶剂（甲醇、乙腈、丙酮）c组织酶消化法（蛋白水解酶酶消化法是在一定的pH范围、一定的温度和一定的反应时间下完成的。其特点是：水解条件温和，水解效率高，无乳化生成。有时可合用一些蛋白酶增活剂，以减少酶用量和缩短消化时间。d超滤法e加热法：热变性蛋白质 影响液-液提取和液-固提取效率的因素分别有哪些？液-液提取1）水相pH碱性药物：PH高于药物的pKa 23单位；酸性物质：VpKa
9、23单位2）提取溶剂提取溶剂的选择既要考虑提取的选择性，同时也要考虑操作是否方便，在满足提取效率的同 时选取极性尽可能小的溶剂，使既有合适的回收率，又可将干扰物质降到最低。一般可根据相似相溶原则进行选择，选择沸点低的溶剂。当样品中药物性质未知时，可用乙醚、氯仿分别作为酸性和碱性药物的提取溶剂。3）离子强度在水相中加中性盐，如NaCl,可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导 致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取。4）有机相和水相体积 1:1或2:1液-固提取分离度和回收率是反映提取效率的重要指标，影响提取率的主要因素是：1）洗脱液流速一一流速太快，
10、分离度下降，样品流失，回收率低，重现性差。2）样品装载量一一有效装载量取决于被测物的容量因子、固定相量和样品浓度。过载，导 致样品流失。3）样品的前处理血样一一血清、血浆可直接上样进行固相萃取，但若药物与蛋白结合，则会降低萃取回 收率 如何根据所取样本、待测物的理化性质设计前处理方法？举例说明。药物的理化性质和存在形式。首先是药物的酸碱性质（pK。）、未电离分子的亲脂性、挥发性 等物理参数。这些涉及药物的提取性质、是否会有挥发损失以及能否采用气相色谱法分析测 定。药物的光谱特性及官能团性质涉及分析仪器的选择以及是否需要进行化学衍生化和是否 需要应用特殊检测器。药物的化学稳定性也涉及样品处理条件
11、的选择。同时应注意药物在体 内的存在形式及血浆蛋白结合率数值，以便采取适宜的预处理方法。选用的生物样品类型样品预处理应根据所选用的待测生物样品的类型不同而变化。如血浆、 血清常需去除蛋白质然后提取，而唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白，取上清液测定药物浓度。要测定尿液中的缀合物常需采用酸水解法或酶水解法使缀合物水解。2-1祥品爺理歩釀与分析方法的选挥示例2庆大霉素血药浓度测定.庆大霉素(gen tamicin )血药浓度范围为4 12mg/ml，在体内不被代谢，以原型存在，蛋白 结合率为30%。庆大霉素与蛋白质结合率低，在沉淀蛋白时较易释放。蛋白沉淀剂有乙腈、甲醇、高氯酸等。 庆大霉素分子中
12、的苷键在强酸条件下易水解，故不宜选高氯酸等强酸除蛋白。庆大霉素水溶 液在pH212范围内稳定，用乙腈或甲醇去蛋白时，上清液pH为8. 59. 5,因此可选这 两种溶剂作为蛋白沉淀剂，特别是乙腈具有弱碱性,药物一蛋白结合物在碱性下更易于释放， 而且蛋白质经乙腈沉淀后形成团块状，易黏附于容器壁上，使上清液澄清便于用吸样器吸取、 转移。庆大霉素结构中含多个羟基，使其具有较强的极性和水溶性，导致无法直接采用经典的液一 液萃取法。从庆大霉素结构看，分子中含有多个游离氨基(伯胺)，可以用1-氟-2,4-二硝 基苯FDNB等紫外衍生试剂，也可以用邻苯二醛0PA等荧光衍生试剂，使庆大霉素变为具有 紫外吸收或荧
13、光的衍生物。因荧光检测灵敏度比紫外检测要高13个数量级，故选择荧光 衍生化试剂0PA。考虑到柱后衍生需要附加装置，所以采用人工的柱前衍生化法，生成的衍 生物可用溶剂萃取，萃取液直接进样或蒸干后加流动相或适当溶剂溶解后进样分析。萃取溶 剂以乙酸乙酯较好。庆大霉素的强极性和解离性，使其更适合固相萃取分离，可采用硅胶和阳离子交换剂作为固 相填料。当在萃取柱上直接衍生化后，生成的衍生物可用乙醇洗脱。根据实验室的条件，血浆样品预处理方法为：乙腈沉淀血浆蛋白后，用0PA柱前衍生化，再 以乙酸乙酯萃取荧光衍生物。然后采用RP-HPLC分离，荧光检测血浆中庆大霉素浓度。 基质效应产生的原因、影响、确认方法以及
14、消除。与标准样品和QC样品相比，生物样品在进行LC-ESI-MS时，会产生明显的基质效应。 原因：生物样品中的内源性物质、代谢产物或一同服用的其它药物，因在色谱分析中与目标 化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。影响：显著降低或增加目标离子的生成效率及离子强度，进而影响测定结果的精密度和准确 度。确认方法：（1）标准曲线测定法：本法需配制3组不同的标准曲线。每组包括5 条标准曲线，每条标准 曲线包括从低到高的7个浓度点，共需测定3X5X7=105个样品。通过比较3组标准曲 线待测组分的绝对响应值、待测组分与内标的响应值比值和标准曲线的斜率，可以确定 基质效应对定量的影响。（2）
15、柱后灌注法：将空白生物样品的提取液和空白溶剂分别进样进行液质分析，同时利用注 射泵将含相同浓度待测物的标准溶液通过色谱柱与质谱接口之间的三通注人到色谱柱 流出液中。如果同空白溶剂的萃取离子图谱相比，空白提取液的萃取离子图谱的响应信 号明显减弱或增强，则表明存在基质效应的影响。基质效应的消除： 选择合适的样品制备方法最有效：实验时可同时次啊用几种不同的样品制备方 法，从中选择基质效应最小的样品制备方法。 改善色谱分析条件：适当地增加保留时间（3rain）、改善多组分间的色谱分离、减 少进样体积。 优化质谱分析条件：改变离子化方式，如 APCI。 内标的选择：稳定同位素标记物 分析方法的确证包括哪些内容。 特异性：在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能 力。内源性物质、代谢产物、配伍药物的干扰等 标准曲线、定量范围、定量下限（LLOQ）：标准曲线反映了所测物质浓度与仪器响应值 之间的关系，一般用回归分析方法所得的回归方程来评价。其到底浓度范围为定量范围。 标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度 准确度：在分析条件下，测得值与真实值的接近程度。准确度的测定通常使用
