神经生物学实验指导

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1、实验9-3 脊髓背根与腹根的机能【目的要求】1. 学习暴露脊髓和分离脊神经背、腹根的方法。2. 了解背根和腹根的不同机能。【基本原理】脊神经的背根是由传入神经纤维组成，具有传入机能；腹根由传出神经纤维组成，具有传出机能。若切断背根，则相应部位的刺激不能传入中枢；若切断腹根，不能传出冲动，则其所支配的效应器也不再发生反应。【动物与器材】蟾蜍或蛙、常用手术器械、金冠剪、弯头金冠剪、刺激器或多用仪、小型弯头露丝电极、蛙板、蛙腿夹、滴管、棉花、红色和白色细丝线、任氏液。【方法与步骤】1. 将蟾蜍或蛙毁脑后腹位固定于蛙板上。沿背部中线剪开皮肤，向前开口至耳后腺水平，向后开口至尾杆骨中段。用剪刀小心剪去脊

2、椎两侧的纵行肌肉及椎间肌肉，暴露椎骨。2. 用金冠剪横向剪断环椎，然后将弯头金冠剪小心伸入椎管，自前至后逐节剪断两侧椎弓（图9-3），移去骨片，暴露全部脊髓（勿损伤脊髓）。3. 用眼科镊轻轻挑开脊髓表面的银灰色或黑色脊膜，再用任氏液冲洗马尾部，小心识别第710对脊神经背根和腹根（图9-4）。用玻璃分针分离一侧第9对脊神经的背、腹根（背根近椎间孔处有淡黄色、半个小米粒大小的脊神经节），将背根穿两条白色丝线，腹根穿两条红色丝线备用。放松两后肢即可进行实验观察。（1）提起白丝线，轻轻用刺激电极钩起背根，打开刺激器，用较弱的单脉冲刺激背根(只引起同侧后肢抖动)，记录结果。（2）用同样的方法刺激腹根，记

3、录结果。（3）将两条白线双结扎背根后从中间剪断神经，分别刺激其中枢端和外周端（刺激强度不变），记录结果。（4）用同样的方法结扎并剪断腹根，重复刺激背根中枢端，记录结果。（5）分别刺激腹根中枢端和外周端，记录结果。【思考题】根据实验结果，说明背根和腹根的机能。 （赵静） 生理学实验第二版P148-149实验9-4 损伤小白鼠一侧小脑的效应【目的要求】一侧小脑损伤后的动物，躯体运动表现异常，通过对异常运动的观察，了解小脑的运动机能。【基本原理】小脑具有维持身体平衡，调节肌紧张和协调肌肉运动等机能。当小脑损伤后，随着破坏程度的不同，可表现出不同程度的肌紧张失调及平衡失调。【动物与器材】小白鼠、常用手

4、术器械、大头针、麻醉口罩、乙醚、棉花。【方法与步骤】1.用乙醚麻醉小白鼠（注意仔细观察呼吸，若呼吸变慢时则表示动物已麻醉）。2.自头顶部至耳后沿正中线剪开皮肤，将颈肌向下剥离。透过透明的颅骨即可看清小脑的位置（图9-5），用大头针刺穿颅骨，直达小脑（2-3mm），搅毁该侧小脑（注意不可深刺，一面损毁脑干）。3.待小鼠清醒后，可见其向一侧旋转或翻滚。如损伤较轻，小白鼠向健侧旋转；当损伤重时，则向损伤侧翻滚。4.将实验用完的小白鼠拉断颈椎处死后弃之。【思考题】根据实验结果说明小脑的生理机能。【创新与探索】设计实验，观察毁其他小动物一侧小脑的效应。 （赵静） 生理学实验第二版149P-150甲醛溶液

5、致炎大鼠疼痛行为的观察疼痛时一种不愉快的主观感受，也是临床常见的病理生理现象。疼痛机制的研究需要以动物模型为研究对象。在众多的疼痛模型中，甲醛模型致炎模型，因其具有高度的有效性和可靠性，且与临床常见的慢性疼痛相似的特点，因而被广泛应用于疼痛机制和镇痛效果的研究。本实验通过大鼠一足底注射甲醛溶液致炎，观察大鼠的疼痛行为反应。【目的】1）了解制作甲醛溶解疼痛模型的基本方法。2）掌握疼痛行为的观察指标及疼痛分数的计算方法。【仪器与试剂】1）仪器：特制实验笼，用透明有机玻璃制成，体积30cm30cm30cm,其下装一面与地面成450角的镜子以利观察。2)试剂:5%甲醛溶液(用无菌生理盐水配制)。【步骤

6、】1）成年Wistar大鼠两只，性别不限，体重200250g,实验前放入实验笼内适应30min，禁食水。随机分布成实验组和对照组。2）实验组：用1ml的标准注射器将5%甲醛溶液50ul迅速注入大鼠任一足底皮下。3）对照组：任一足底皮下注射0.9%生理盐水50ul.4）注射后，立即将大鼠放回实验笼内，观察并记录各种行为反应持续时间。每5分钟为一个时间段，共计50min,10个时间段。所用行为指示：A. 双足着地，体重均匀分配；B。注射足轻着地；C。抬起注射足；D.添咬注射足。5）计算各时间段的疼痛分数（S）。6）S=B+2C+3D/N.7)根据疼痛程度依次将A、B、C、D四种行为表现，分别评为0

7、.1、2、3分。B、C、D分别表示5min记录到的各行为反应的持续时间（s）,N表示时间段。8）以疼痛分数为纵坐标，时间为横坐标做疼痛分数曲线图（图2-1-2）。【思考题】1. 与对照组比，甲醛溶液注射组疼痛分数如何变化？2. 实验组的疼痛分数曲线有何特点？ （利 梅 李菁锦）实验神经生物学P324-325【参考文献】利梅，李菁锦，吕国蔚.2000.PKC抑制剂抑制大鼠一足福尔马林致炎痛的迟反应. 中国疼痛医学杂志. 6（4）:206209Alreja M. et al. 1984. The formalin test: a tonic pain model in the primate. P

8、ain. 20:97105Dubuisson D and Dennis SG. 1997. The formalin test : a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats. Pain. 4: 161174胞外记录弱噪声前掩蔽对下丘频率调谐曲线的影响【实验目的】探讨在加入弱噪声前掩蔽的条件下,下丘神经元对声信号的频率调谐的影响。【动物与器材】动物：健康、听力正常的昆明小鼠（Km）1只，体重2025 g，雌雄不

9、拘。器材：常用手术器械、玻璃微电极（阻抗5-10 MW）,502强力胶，无回声屏蔽室，IC声反应信号的记录系统。声刺激系统包括函数信号发生器(GFG-8016G, Good Will Instrument Co., LTD)、白噪声发生器(ND-502, 南京大学)、短声发生器（自制）、声强衰减器（LAT-45, LEADER, Japan）、高频功率放大器(自制)和超声喇叭（AKG model CK50，直径1.5 cm，1.2 g，频率响应1100 kHz）。声刺激系统用声级计（Brel and Kejael (B&K) -2610, Denmark）和1/4英寸麦克风（4139，B&K）

10、校正，声强用dB SPL表示（0 dB SPL相当于20 Pa）。【方法与步骤】1,手术操作过程(1) 用0.48%的戊巴比妥钠（Nembutal 6190 mg/kg b.wt.）腹腔注射麻醉，剪去动物头顶被毛，头顶正中切开头皮，暴露颅骨，除去表面的薄层肌肉和结缔组织，并用95%酒精棉球反复擦拭，使颅骨表面脱脂，清理创面。(2)用502强力胶将一根1.8 cm长平头铁钉固定在头顶颅骨上，并用牙科水泥加固，以便实验过程中固定动物。(3) 根据人字缝找到下丘（inferior colliculus, IC）所在位置（如图1.1所示），在此处将颅骨钻一个200500 m的小孔，并挑破脑膜,以便玻璃

11、电极能够顺利插入。图1.1 下丘解剖学位置（Jen et al 1998） (4) 将动物安放于无回声屏蔽室内的防震实验台上，动物头部的铁钉被固定在自制的支架上，以防止头部移动，保持动物耳眼线与扬声器中心处于同一平面。(5) 在(3)中打孔位置(IC表面)垂直插入单管玻璃微电极（内充灌2 M NaCl溶液，阻抗510 MW），用于记录声刺激下IC神经元的反应。2.用声刺激系统进行声刺激 (1)自由声场刺激条件下给出短纯音（tone burst），时程为40 ms，上升/下降时间均为5.0 ms。刺激频率2次/秒（图1.2）。喇叭固定在俯仰方位0平面、经向方位（azimuth）对侧600。 (2

12、) 神经元反应由微电极引出，经生物电信号放大器（ISO-DAM，WPI，USA）放大后输至示波器（PM3084，FLUKE, USA）监视、至监听装置监听和至计算机采样储存（图1.3）。图1.3实验装置示意图3.记录IC神经元的声反应和频率调谐曲线(1) 先用纯音找寻IC声敏神经元，并记录其深度（depth）、CF和MT。(2)从MT开始，按10 dB幅度依次递增声强，并分别向CF的高、低频边改变探测声频率，找到刚能引起神经元反应的最高和最低频率，得出频率调谐曲线（frequency-tuning curve, FTC）。4 对频率调谐曲线进行数据分析神经元的声反应电信号经模/数（A/D）转换

13、后进入计算机收集和储存。（1） FTC的锐化程度用Qn值（Q10，Q30）来评价。其中Qn值是由神经元FTC的BF除以最小阈值上10 dB或30 dB的频率带宽所得到的。（2） 选用反转斜率（inverse-slope，IS，ISF/I kHz/dB）来比较FTC高低频边的变化是否一致。反转斜率的数值即为当强度从MT阈上10 dB变至30 dB时FTC高低频边分别增加和减小的值除以20 dB（3010 dB20 dB）。(3)有关数据由Origin6.0和Sigmaplot2000软件做进一步统计分析和作图。数据表述基本使用平均值标准差（M SD）。【注意事项】1记录时用小儿头皮注射针经腹腔给

14、0.6%戊巴比妥钠溶液，根据动物反应注入，维持于浅麻醉状态。2屏蔽室内本底噪声29dB SPL，温度控制在2528。微电泳注射神经递质阻断剂BIC对FTC的影响【实验目的】1 微电泳注射神经递质阻断剂BIC，神经元的特征参数的变化。2 检测GABA能参与神经元前掩蔽【动物与器材】动物：健康、听力正常的昆明小鼠（Mus Km）12只，体重2025 g。器材：常用手术器械，单管和多管玻璃微电极（阻抗5-10 MW）,502强力胶，无回声屏蔽室，声刺激系统，IC声反应信号记录系统【方法与步骤】1,对动物手术，剪头皮，钻洞，粘钉子固定，插入电极（详细步骤同上）。2, 制备并组装单管微电极和多管微电极用

15、于记录神经元反应及微电泳导入药物。单管电极用内径1mm玻璃毛坯在电极拉制器（Bioscience，UK）上拉制。多管电极制备方法参照Godwin (1993)，用三管电极毛坯在拉制器上拉制，三管尖端总直径约10-15m。将单管电极和多管电极以“骑背式（piggyback）”组装在一起（图2.1）。所用溶液与药品配制为：单管电极内充灌2M NaCl 溶液，阻抗510 MW；三管电极中的两管内充灌2M NaCl 溶液，分别用于电流平衡和接地，另一管内充灌10 mmol BIC溶液，用于药物离子电泳注射。三管电极经Ag-AgCl丝连接至离子电泳仪（WPI，USA），滞留电流-10 nA，注射电流10100 nA。