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1、 华中农业大学植物显微技术 院系：园艺林学学院专业：果树学学号：08305110043姓名：谢该生2009年5月湖北武汉基因组原位杂交技术在植物研究中的应用摘要：基因组原位杂交技术作为植物分子细胞遗传学研究的重要手段，以其安全、精确、直观、信息丰富的特点，被广泛地应用于杂种染色体分析，物种的起源、进化和亲缘关系探索，染色体行为考察等方面。文中就基因组原位杂交技术发展过程以及在植物中的应用方面进行阐述，并简述了染色体原位杂交技术最新技术发展，简要讲叙了如何利用原位杂交技术通过细胞检测、染色体检测、基因检测来进行植物研究。关键词：基因组原位杂交，荧光原位杂交，植物，基因组Genomic in si
2、tu Hybridization Technologyand Its Application in PlantAbstract : Genomic in sit u hybridization ( GISH) technology is an important means in plant molecular cytogenetics research ,with its characteristic of safety ,accuracy ,visualization and rich information. It has been extensively applied in anal
3、ysing hybrid chromosome or chromosome fragments , exploring species origin ,evolution and affinity ,revealing chromosome behavior and so on. This is a summary of GISH technology in plant study. A new developement of chromosome in situ hybridization and introduces how to do plant research through cel
4、l detection ,chromosome detection and gene detection by use of in situ hybridization are presentedKey words : Genomic in sit u hybridization ( GISH) ; Genome ; Chromosome基因组原位杂交是以亲本之一的总基因组DNA做探针，另一亲本的基因组DNA做封阻，在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种染色体/染色质检测技术。1 基因组原位杂交技术的发展原位杂交（in situ hybridization， ISH），属于固相分子杂交范畴，
5、它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织、细胞或染色体上特定的核苷酸序列的一种技术。80年代末发展起来的荧光原位杂交技术(in situ hybridization， ISH），属于固相分子杂交范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织、细胞或染色体上特定的核苷酸序列的一种技术。该技术最早时使用放射性元素32P标记的外源核酸片段为探针,与组织、细胞或染色体的特定序列杂交并进行检测。荧光原位杂交技术（fluorescence situ hybridization， FISH）就是在原位杂交技术基础上通过对标记技术的改进而来的。FISH用生物素、地高辛、荧光素等标记物标记探针，
6、将标记的探针与组织、细胞或染色体的DNA、RNA原位杂交，通过荧光免疫反应检测目的DNA或RNA在组织、细胞或染色体上的位置，并通过荧光显微镜直接观察结果。FISH 的发展改变了以往用放射性标记做探针的弊端：如实验周期长，对操作人员危害大和废物难处理等，因此广泛的应用于人类医学、动物和植物学的研究中。FISH 技术在不断的发展，目前在植物研究中广泛使用的基因组原位杂交技术（genomic in situ hybridization， GISH）就是在荧光原位杂交技术上发展起来的。基因组原位杂交的原理与荧光原位杂交相同，不同的是所用的探针。基因组原位杂交是以来源不同的亲本之一的总基因组DNA做探
7、针，通过生物素、地高辛、荧光素等标记物标记后，再原位杂交到杂种染色体制片上，接着通过与该标记物耦合的荧光素免疫反应，检测该亲本染色体或染色体片段在杂种中的存在状况；而其它亲本的基因组总DNA（或非探针的其它DNA）以一定的浓度比例来封闭杂种染色体上探针的非特异结合位点，尽可能使杂种染色体上的特异位点暴露出来供探针杂交。基因组原位杂交技术分为5个主要步骤：即探针的制备和标记、染色体标本的制备、杂交反应、显色及荧光检测、杂交结果分析。具体的技术路线为：选取适宜做基因组原位杂交的实验材料；对所选的材料进行充分的酶解，以去除细胞壁和细胞质；将酶解后的材料进行染色体制片并从中选取质量好的片子用以杂交实验
8、；同时提取亲本的总基因组DNA，分别制备成探针DNA和封阻DNA，用以制备杂交混合液。在杂交前对染色体制片进行一定程度的处理，以便杂交实验更好地进行，将制备好的杂交混合液变性后加到染色体制片上，杂交16 20h，杂交后分别进行洗脱、显色、荧光检测及结果分析。GISH发展到现在，虽然只有十多年的历史，但已广泛地应用于植物的多方面研究。2 原位杂交技术的新进展近几年来，在最初的染色体原位杂交的基础上发展起来许多新的技术，包括DNA纤维荧光原位杂交（DNAfiber - FISH）基因组原位杂交（Genome Ie Situ Hbridization，GISH），多色荧光原位杂交（mFISH）。染色
9、体显带技术与原位杂交技术相结合创建了原位杂交显带技术，PCR 与原位杂交技术结合创建了染色体引物原位DNA合成技术（Primer In Situ DNA Synthesis，PRINS）及原位PCR技术（PCR In Situ）。2. 1 细胞检测FISH 简化了染色体结构变异的检测。染色体易位在中期细胞中最容易被检测到，它们也能在染色体着色后的间期细胞的染色体区域断裂或通过与抗特异病害断裂点两侧探针的接近而被检测，通过在间期或中期两侧标记的邻近比较异常和正常细胞。含有几种植物染色体类型的体细胞杂种在绘制染色体基因或建立染色体特异性DNA序列文库方面是非常重要的资源。由于植物细胞染色体在培养中
10、可能迅速丢失或重排，因此杂种细胞遗传学特性标准化是十分必要的，这用FISH 很方便地做到。植物染色体的非整倍体是由于染色体行为异常，即可能是双亲配子染色体数目和结构差异引起或染色体亲缘关系较远，在细胞分裂过程中产生落后等现象导致。通过原位杂交可比较容易地检测出缺失、附加或代换的染色体。2. 2 染色体检测2.2.1 远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测育种学家们为了能够利用远缘野生种中对栽培种有利的基因常采用杂交或体细胞融合的方法创造远缘杂种并不断地用栽培种回交，以期将野生种的遗传物质转入栽培种中。运用GISH方法，跟踪检查杂种的真实性以及后代外源染色体或片段的品系，对外源染色体或片段计数，显示它
11、们的大小、位点和形态以及与寄主基因组染色体的重组。一般以标记的野生种基因组总DNA为探针，以栽培种亲本总DNA为封阻DNA，在杂种及其后代中期染色体进行杂交，通过信号的有无来判断是否有野生种染色质渗入。通过这种方法清晰地显示出普通小麦与东方旱麦草异附加系和异代换系、小麦与大赖草的染色体易位系，而易位对于转入有利性状具有重大意义。该技术在认为难以成功的水稻上应用，成功地鉴定了栽培水稻紧穗野生稻和栽培水稻药用野生稻F1的真实性及回交后代中的异源附加系。因此，无需经过基因表达产物来推断基因转移与否，就能检测整合于染色体内的和游离的外源染色质。2.2.2 物种进化及亲缘关系探讨利用原位杂交技术，还可以
12、通过研究或鉴别基因组的类型及同源性来探讨物种进化及亲缘关系。采用原位杂交技术，根据杂交结果即可推测异源多倍体的1对多倍体植物的研究色体组成或异源染色体片段的渗入情况。采用基因组原位杂交，根据杂交信号位点的多少，判断同源序列的多少，进一步推测物种间亲缘关系的远近，在多倍体小麦中染色体的起源和进化方面有较多报道。除此之外，可利用原位杂交技术来研究基因组、同源染色体在细胞中的空间分布的随机性和有序性，这与染色体行为、基因表达、DNA复制，以及基因组的进化包括物种的形成都密切相关。2. 3 基因检测从1985 年Rayburn 等首次将生物素标记探针及其检测系统应用于植物染色体原位杂交开始，目前已将许
13、多特定DNA序列作了定位研究。随着原位杂交技术的改进，已从最初的将特定DNA序列在染色体或间期核的定位，发展到用单拷贝序列和多拷贝序列构建染色体的物理图谱。重复序列和多拷贝基因家族的图谱构建重复序列在染色体上的位置难以用常规的作图方法定位，由于原位杂交不受位点内变异和位点内拷贝数的影响，荧光原位杂交（ FISH）已成为重复序列和多拷贝基因家族作图的重要手段。例如栽培稻的染色体多倍体是植物进化过程中的普遍现象，70%的被子植物和大部分经济作物都是多倍体。植物多倍体在生产上有重要的意义，如：三倍体的甜菜耐寒，含糖量高，产量高，成熟多倍体的花卉花大而香味浓；还有其它已出现在生活中的多倍体植物如：无籽
14、西瓜、葡萄和香蕉等。关于多倍体的起源，进化途径等研究领域，许多植物仍处于一种不明确的状态， GISH技术作为一种有效手段，可对人工培育或天然多倍体植物的基因组之间亲缘关系、基因组组成及起源等方面进行研究。24 杂种中来源不同的染色体组成分析杂交育种技术是近几十年来育种学家创造新种质的重要手段之一。通过育种材料间优良性状的整合，培育出高产、优质、抗逆性强、抗病虫害的新品种。杂交种中的亲本来源分析有助于育种家了解基础育种材料的特性，提高试配组合的目的性、准确性、高效性。2. 5 易位系、代换系和附加系中外源染色质的检测和定位深入研究异源染色体的易位、代换、附加的机制对于植物遗传学基础研究和异源染色
15、体种间转移有重要意义。GISH技术可以对易位系、代换系和附加系进行有效的鉴定，而且可对易位、代换、附加的染色体或染色体片段的来源、大小、数目及发生位点进行分析。2. 6 物种之间同源性的确定植物科属种间基因序列的同源性及排列顺序相似性的发现是植物遗传学研究的主要成就之一，对某些重要农艺性状基因在不同属种间的内在联系研究将会对品种改良产生指导和推动作用。GISH已在多种植物的同源性研究中发挥了作用。宁顺斌等（2000）在研究玉米和水稻亲缘关系时发现，用玉米基因组DNA为探针与水稻染色体杂交时，水稻染色体显示连续的杂交信号。用水稻基因组DNA为探针和玉米染色体杂交时，玉米染色体上都显示出多个间隔的杂交带区。这一结果表明，玉米和水稻基因组在所有染色体上存在同源性。2. 7 杂种中不同来源染色质在核中区域分布研究1989 年，Schwarzacher等对智利大麦（+）非洲黑麦的杂种后代的亲本基因组组成的GISH 研究中指出：在分裂间期和前期，来自不同亲本的染色质处在核的不同区域，并按照一定的空间组织排布，而并非象人们通常所想象的那样：来源不同的染色质是随机混合在一起的。2. 8 基因组原位杂交在其它方面的应用在细胞遗传学中，研究减数分裂染色体的行为可更好地了解基因组与基因组之间的关系。Cai和Jones（1997）应用GISH 技术，通过对同源联会的分析证明中间
