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1、5.1.1实验过程5.1.1.1SM-GA-BSA抗原的制备5.1.1.1.1SM与BSA的初始比对偶联效果的影响1、pH9.6的碳酸盐缓冲液的配制；称取碳酸钠10.2g及碳酸氢钠16.8g溶于双蒸水中定容至6000ml；4 冰箱保存备用；2、称取五组200mgBSA分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得A、B、C、D、E溶液；3、分别称取50mg、100mg、200mg、400mg、800mg链霉素，并将其分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得a、b、c、d、e溶液；4、将Aa、Bb、Cc、Dd、Ee混合，再分别向五组中缓慢加入0.2mL25%的戊二醛，边加边搅拌。；5、
2、将加入戊二醛后的五组溶液置于室温下搅拌反应6h；6、0.01mol/L、pH7.4PBS缓冲液的配制；称取8.0g NaCl、0.1g KCl、2.9g Na2HPO412H2O和0.2g KH2PO4,加双蒸水溶解，定容至1000mL，4 冰箱保存备用；7、反应完后用pH7.4的PBS缓冲液透析1d；8、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；9、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；10、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定链霉素与BSA的最佳初始量x。5.1.1.1.2戊二醛的量对偶联效果的影响1、称取五组链霉素
3、与BSA（第一组实验的最佳初始量x）分别溶于碳酸盐缓冲液中，获得A、B、C、D、E溶液；2、向每组分别缓慢加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL25%戊二醛，边加边搅拌，获得a、b、c、d、e溶液，将其置于室温下搅拌反应6h；3、反应完后用pH7.4的PBS缓冲液透析1d；4、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；5、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；6、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定戊二醛的最佳加入量y。5.1.1.1.3偶联时间对偶联效果的影响1、称取五组一定质量的链霉素、BSA
4、（第一组实验的最佳初始量x），并将其溶于100mL的碳酸盐缓冲液中；2、分别向五个组中加入一定量的戊二醛（第二组实验的最佳加入量y），边加边搅拌；3、将五个组置于室温下，分别搅拌反应2h、4h、6h、8h、10h；4、待每组反应完后，用pH7.4PBS缓冲液透析1d；5、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；6、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；7、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定最佳反应时间t。5.1.1.2链霉素-GA-OVA包被原的制备其方法与SM-GA-BSA抗原的制备相同。5.1.1.3根据以上三组
5、实验，利用正交法分析出链霉素在用戊二醛合成抗原时的最优条件1、根据上述三组实验的x，y，t对应分别设置三个变量；2、对链霉素与戊二醛的初始比变量进行设置，x-1、x、x+1；3、对戊二醛的量进行设置，y-0.1、y、y+0.1；4、对偶联时间进行设置，t-2、t、t+2；5、设计三因素三水平的正交试验；6、对正交实验结果进行方差分析、F检验，确定出最优偶联条件。5.1.1.4对不同偶联条件下的偶联液进行SDS-PAGE凝胶电泳：1.各种溶液配制：30%丙烯酰胺：准确称取29g丙烯酰胺和0.8 g 双丙烯酰胺溶于60mL双蒸水中，于37溶解，然后补双蒸水至100mL，棕色瓶4保存浓缩胶缓冲液(1
6、mol/L Tris-HCl，pH6.8)：6.06gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水加至50mL，4保存分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8):9.08gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水加至50mL，4保存10%SDS：25gSDS，用双蒸水溶解至250mL。室温保存10%过硫酸铵(5ml)：0.5 g过硫酸铵溶解于5ml 双蒸水，可在密封的管内，4存放数月4分离胶缓冲液(100ml):75ml 1.5mol/l Tris-HCl(pH 8.8),4ml 10% SDS,21m
7、l 蒸馏水,可在4存放数月4堆积胶（浓缩胶）缓冲液(100 ml):50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),4ml 10% SDS,46ml 蒸馏水,可在4存放数月电泳缓冲液(1L):3g Tris 碱,14.4g 甘氨酸,1g SDS,加蒸馏水至1L,pH 应该在8.3左右，在室温下长期保存5样品缓冲液(10ml):0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),5ml 50%甘油,2ml 10% SDS,0.5ml 2-巯基乙醇,1ml 1% 溴酚蓝,0.9ml 的蒸馏水,可在-20保存数月考马斯亮蓝染色液(1L)：考马斯亮蓝R-250,1g;甲醇,450m
8、l;蒸馏水,450ml;冰醋酸 100mL.脱色:脱色液(1L)：甲醇,100ml;冰醋酸,100ml;蒸馏水,800ml.2.具体操作步骤：X%分离胶的计算：采用12%的分离胶A液 x/3mlB液 2.5ml蒸馏水 （7.5- x/3）ml10%过硫酸铵 50mlTEMED 5ml总量 10ml灌制分离胶A.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。B.将A液、B液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。C.加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀，凝胶很快会凝固，所以操作要迅速。D.
9、小心将凝胶液用吸管或移液枪沿隔片缓慢加入模具内，避免在凝胶内产生气泡。E.当加入适量的分离胶溶液时（凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm）,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层15mm的水层或异丙醇，这使凝胶表面变得平整。F.等待3060min,使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清洗的界面。聚合好后微微倾斜模具，用吸管或移液枪将水层或异丙醇层吸出，用吸水纸擦干残留水渍。灌制堆积胶堆积胶经常使用5%的浓度，还是以两块量为例，成分如下：蒸馏水 2.3mlA液 0.67mlC液 1ml10%过硫酸铵 30ulTEMED 5ul按以下步骤操作：A.将A液、C液和蒸馏水在
10、三角瓶中混匀B.加入过硫酸铵和TEMED,并轻轻搅拌使其混匀C.将堆积胶加到分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端D.将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。E.约30min凝胶聚合，聚合后小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。F.将凝胶放入电泳槽中，将电泳缓冲液加到内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。制备样品和上样将各种样品（纯化前样品、过亲和柱后样品、加热后样品、0h取样的样品、空载质粒的样品）与5样品缓冲液在一个Eppendorf管中混合，100加热210min。稍微离心，将样品加到样品孔中。将样品加到加样孔的底部，并伴随着染料水
11、平的升高而升高加样枪头，避免带入气泡。为了避免边缘效应，在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。电泳接通电源，将电压调至150200V之间开始电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。结束后从电泳槽中取出玻璃板，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶。采用考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色液：1L考马斯亮蓝R-250 1g甲醇 450ml蒸馏水 450ml冰醋酸 100ml染色过程：将胶置于染色液中，振荡染色0.51h,有时根据染色液用过的次数多少，适当延长染色时间。脱色脱色液：1L甲醇 100ml冰醋酸 100ml蒸馏水 800ml弃去染液，将凝胶在水中漂洗几次，加入脱色液直至背静干净，条带清晰可见。所需
12、药品与器材：链霉素，戊二醛，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸钠，碳酸氢钠，氯化钠，氯化钾，十二水磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，盐酸，蒸馏水，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris，盐酸，SDS，过硫酸铵,甘氨酸，甘油，2-巯基乙醇，1%溴酚蓝，甲醇，冰醋酸，考马斯亮蓝R-250，TEMED烧杯，容量瓶，分光光度扫描仪，透析袋，垂直电泳仪，磁力搅拌器，电子天平，移液管实验五、纯化酶的电泳检测及比酶活测定1、实验目的学会采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析基因工程产物和蛋白质的纯度鉴定及测定酶的比酶活2、实验原理SDS-PAGE电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。如果在PAGE系统
13、中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小，而与蛋白质所带的电荷和形状无关。SDS是阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。由于大多数蛋白质与SDS结合的摩尔比为1.4：1，结合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白质表面的负电荷，屏蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷。SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化，使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。在巯基乙醇的作用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴趋于一致，长轴与分子量成正比。因此，它们的电泳速度不取决于电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。目前较流行的SDS-
14、PAGE使用的都是线性垂直薄板状胶，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品，使聚合、染色脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶的应用更广泛，本实验是按照Bio-rad的小凝胶系统来设计的，这些步骤也适用于其他系统。经过亲和层析和加热纯化后，重组木聚糖酶应该在SDS胶片上显示出一个单一的条带，分子量应该与预期的一样，为40 kDa左右。同一个酶在相同的测定条件下，如果比酶活越高，则表示该酶的纯度越大，本实验中的木聚糖酶经过了亲和层析和加热两步纯化后，比酶活应该逐渐升高，且经过亲和层析后和加热后的比酶活相差不大。3、实验材料和设备A. 试剂丙烯酰胺（电泳级）双丙烯酰胺（N,N-甲叉双丙烯酰胺）Tris碱SDS (十二烷基磺酸钠，分析
