《格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响.docx（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响【摘要】 目的： 探讨格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响. 方法： 取分离鉴定的Wister大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体悬浮液,加入到含有K+和KATP通道阻滞剂ATP的待测溶液中,再按如下分组进行药物干预,即空白对照组、特异性mitoKATP激活剂二氮嗪组、Dia+Glip组,即刻检测溶液在3 min内光散射值的变化,以此作为反映线粒体体积变化的指标. 结果： 各组线粒体体积均随时间增大,Con组增加速度极慢,Dia组最快,而Dia+Glip组则介于两者之间.不同浓度Glip均能使两种大鼠线粒体体
2、积增加速度减慢,高浓度作用更明显；相同浓度Glip对不同大鼠组的影响程度不同,对糖尿病GK大鼠的影响明显弱于正常大鼠. 结论： Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱. 相当于临床治疗中血药浓度峰值的Glip浓度虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿病大鼠心肌mitoKATP无显着影响.【关键词】 格列吡嗪 糖尿病 心肌 线粒体ATP敏感性钾通道 0引言 磺脲类药物因为高效的降糖作用而广泛应用于2型糖尿病的治疗. 它主要通过结合胰岛细胞膜上磺脲类药物受体引起细胞膜上ATP敏感性钾通道关闭而发挥作用.但研究证实大部分磺胺类药物也能关
3、闭心血管组织的KATP1. 而后者在心肌缺血时的激活对于启动心肌缺血预适应，降低缺血对心肌的损伤发挥着主要作用,并且线粒体ATP敏感性钾通道相对于细胞膜ATP敏感性钾通道所起的作用更重要,mitoKATP是IPC的最终效应器2-3.目前已明确磺脲类药物格列吡嗪对心血管组织sarcKATP有阻滞作用,但少见其对心血管mitoKATP直接影响的报道. 我们应用线粒体悬浮液定量光散射测定技术研究Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP的影响，探讨Glip对缺血性心肌的安全性、指导临床对缺血性心脏病患者降糖药的选择. 1材料和方法 材料89 wk雄性Wister大鼠和糖尿病GotoKakizak
4、i(GK)大鼠各20只，体质量220250 g(上海斯莱克实验动物有限公司)；Glip纯品；蔗糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、琥珀酸钠、丙二酸、延胡索酸；蛋白酶；牛血清白蛋白；二甲亚砜；HEPES，ATP公司；Percoll；二氮嗪，鱼藤酮、寡霉素；高速冷冻离心机；723型可见分光光度计. 方法 线粒体制备大鼠禁食过夜,断头处死,迅速取出心脏. 依据Riess等4的方法提取线粒体,略作改动,简述用少量冰预冷分离介质(250 mmol/L蔗糖,10 mmol/L HEPES,5 mmol/L KEGTA,用NaOH调pH至)漂洗心脏,在含1 g/L蛋白酶的分离介质中剪碎心脏至肉糜状,分离介质用5 g/L
5、牛血清白蛋白调整至倍体积,用匀浆器制成匀浆液,1700 g离心4 min,取上清液9000 g离心5 min,将沉淀吹打重悬浮于分离介质中,2300 g离心2 min,收集上清液,9000 g离心5 min,得到线粒体沉淀,将沉淀重悬浮于不含KEGTA的分离介质中.采用自发形成Percoll密度梯度的方法进一步纯化线粒体.最后将所得线粒体沉淀以蛋白浓度3540 g/L悬浮在不含KEGTA的分离介质中,冰浴中保存备用. 以上操作均在04进行,从动物处死到首次离心间隔少于4 min. 参照Castilho等5方法 ，用测定线粒体内膜关键酶琥珀酸脱氢酶活性法进行线粒体鉴定. 双缩脲法测定线粒体蛋白浓
6、度. 线粒体体积测定用定量光散射技术测定线粒体体积变化. 当线粒体悬浮液中线粒体蛋白浓度为 g/L时,在经过蛋白浓度无限大时吸光度值校正后,线粒体悬液光散射值与溶液在520 nm，25的吸光度值的倒数呈线性相关4. 因此反映线粒体体积变化的线粒体悬液值可由这两个吸光度值计算所得6. 实验中线粒体悬液为含K+待测溶液,包括120 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES， mmol/L EGTA，10 mmol/L琥珀酸盐， mmol/L MgCl2，5 mmol/L 磷酸盐，5 mol/L鱼藤酮， mol/L寡霉素，200 mol/L ATP(KATP阻滞剂) , 取分离鉴定的Wi
7、ster大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体,加入到上述待测溶液中,再按如下实验分组进行药物处理,即刻用723型可见分光光度计监测溶液3 min内在520 nm，25的吸光度值变化,然后换算成光散射值. 实验数据以线粒体悬液光散射值变化百分比表示Glip对线粒体体积变化的影响程度. %=(Glip)/(Dia) =(Glip)-(Con)/(Dia)-(Con)1004,其中(Con)，(Glip)，(Dia)分别是实验特定时间点对照组、Glip组和二氮嗪组值. 动物分组将Wister大鼠和GK大鼠各分4组. 二氮嗪组：加入特异性mitoKATP激活剂二氮嗪； Glip低剂量组：二氮嗪后加入
8、5 mol/L Glip； Glip高剂量组,二氮嗪后加入50 mol/L Glip； 空白对照组：加入相应体积的含K+待测溶液. 其中Glip和二氮嗪溶解于 mL/L DMSO中,在本实验条件下, mL/L DMSO对实验结果无影响. 统计学处理：数据以xs表示,应用软件进行统计学分析,两组间均数比较应用t检验,两组以上均数比较应用方差分析,方差齐性用最小显着差法(LSD)检验,为差异具有统计学意义. 2结果 各组大鼠心肌线粒体体积随时间的变化各组的线粒体悬液光散射值(值)均随时间有程度不等升高. 各大鼠心肌线粒体悬液光散射值在空白对照组上升速度非常缓慢,在加入二氮嗪后速度明显加快. 两者在
9、Wister大鼠实验结束时值分别为，,差别具有显着统计学意义；两者在GK大鼠实验结束时值分别为，,差别具有显着统计学意义；两者3 min时间点值相对于实验起始点增加百分比在Wister大鼠分别是%和%,差别具有统计学意义，在GK大鼠分别是%和%,差别具有统计学意义. 对大鼠心肌线粒体体积变化的影响加入5，50 mol/L Glip后，线粒体体积增加速度减慢,线粒体悬液值随实验时间延长较二氮嗪组下降明显. 图3为实验各组在加入药品后120 s时的%值,不同浓度Glip均会使Wister和GK大鼠心肌线粒体体积增加速度减慢,高浓度组的影响较低浓度组更明显,差异具有显着统计学意义. 在不同大鼠组别中
10、,相同浓度的Glip降低心肌线粒体体积增加速度的程度不同,对GK大鼠的影响明显弱于Wister大鼠组,并且随着Glip浓度增加,两者之间的差异也变大. 3讨论 我们采用线粒体悬液定量光散射测定技术研究了Glip对大鼠心肌组织线粒体KATP通道的影响. 发现在含有mitoKATP抑制剂ATP的大鼠心肌线粒体悬液中,线粒体体积增加缓慢,而加入特异性mitoKATP激活剂二氮嗪后线粒体体积急剧上升,这与Costa等6的研究结果相一致,表明在本实验条件下线粒体体积的增加是mitoKATP开放的结果. 我们发现加入Glip使二氮嗪引起的线粒体体积增加程度明显下降,并且呈浓度依赖性,即高浓度组的作用较之低
11、浓度组更明显,从而证实Glip能够关闭mitoKATP. 由于mitoKATP在缺血预适应保护心肌中发挥着不可替代的作用,因而关于其分子结构的研究报道很多,最近Cuong等7发现磺脲类药物受体2而非SUR1参与了大鼠心肌mitoKATP的构成,并且已有研究表明Glip虽然亲和力很低，也能够与心血管组织sarcKATP上的SUR2亚单位结合. 因此Glip关闭大鼠心肌mitoKATP可能是它与mitoKATP上SUR2亚单位结合的结果. Glip虽可关闭mitoKATP,但它的这种作用较之格列本脲明显弱. 既往研究表明50 mol/L格列本脲几乎完全阻断mitoKATP的开放,而本实验结果显示5
12、0 mol/L Glip仅能使mitoKATP活性下降约一半,显示出Glip对KATP通道的选择性明显高于格列本脲,对心肌mitoKATP的亲和力极低,即使在相当于临床治疗中血药浓度峰值的浓度下它对心肌mitoKATP的作用也很微弱.这可以解释Flynn等8的研究结果,该研究发现Glip并不影响麻醉大白兔的心肌缺血预适应. 我们同时也比较了Glip对正常及2型糖尿病大鼠心肌组织mitoKATP的影响,发现相同浓度的Glip对糖尿病大鼠心肌mitoKATP的关闭作用较之正常组明显减弱,提示糖尿病状态下心肌mitoKATP对Glip的反应性降低,推测具体机制有：糖尿病时氧化应激和蛋白糖基化使得mi
13、toKATP对刺激的敏感性下降9-10,糖尿病时细胞代谢水平的降低也减弱了mitoKATP对药物的反应能力. 并且研究也发现,Glip在相当于血药浓度峰值的浓度下,对正常大鼠心肌mitoKATP有轻微关闭作用,但对糖尿病心肌mitoKATP不产生具有统计学意义的影响. 总之,通过以上研究表明,Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱,因而在有必要进行明确其中机制研究的同时,也必须认识到在非糖尿病状态下得出的关于Glip对心肌缺血预适应影响的结果并不适用于糖尿病状态. 相当于血药浓度峰值的Glip虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿
14、病大鼠心肌mitoKATP无显着影响,这提示我们临床治疗剂量的Glip对于缺血心肌可能是安全的. 【参考文献】 1 Meier JJ, Gallwitz B, Schmidt WE, et al. Is impairment of ischaemic preconditioning by sulfonylurea drugs clinically importantJ? Heart, 2004,90:9-12. 2 Das B, Sarkar C. Pharmacological preconditioning by levosimendan is mediated by inducible
15、nitric oxide synthase and mitochondrial KATP channel activation in the in vivo anesthetized rabbit heart modelJ. Vascul Pharmacol,2007,47:248-256.3 Ardehali H, ORourke B. Mitochondrial K(ATP) channels in cell survival and deathJ. J Mol Cell Cardiol, 2005,39:7-16.4 Riess ML, Costa AD, Carlson RJr, et
16、 al. Differential increase of mitochondrial matrix volume by sevoflurane in isolated cardiac mitochondriaJ. Anesth Analg,2008,106:1049-1055.5 Castilho RF, Vicente JA, Kowaltowski AJ, et al. 4,6Dinitroocresol uncouples oxidative phosphorylation and induces membrane permeability transition in rat liver mitochondriaJ. Int J Bioc
