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1、部 门职务/岗位签 名日 期起草技术审核质量把握室质量把握室化验员主任法规符合性审核文件格式审核批准质量保证室质量保证室质量治理部质量运行岗文件治理员经理生效日期复审日期年月年月日日颁发部门文件拷贝号质量治理部分发部门质量治理部 设备部物资部总经理办公室质量保证室销售部生产部车间质量把握室大肠埃希菌检查 SOP1. 目的建立一个规程，标准大肠埃希菌计数操作方法。2. 范围本规程适用于 xxxxxxxxxx 公司质量把握室对水质、碳酸钙成品及其他的微生物限度检查。3. 职责QC 检测人员负责依据本规程进展样品检测和记录；QC 负责人及监管人员有权对检测过程及结果进展监视检查，有权制止不符合规程的
2、操作并向 QA 提出重试恳求，得到 QA 批准前方可进展重试。必需开启偏差记录来解决不符合规程的操作。4. 物料和设备4.1 试剂和材料pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二 氢钾3.56g 、无水磷 酸氢二 钠 5.77g 、氯化钠4.30g 、蛋白胨1.00g，加水 1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。胰酪大豆胨液体培育基：胰酪胨 17.0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g 磷酸氢二钾 2.5g以上成分混合加水 1000ml，微温溶解，滤过，调整 PH 使灭菌后在 25的pH 为 7.30.2，参与无水葡萄糖 2.3g 或葡萄糖 2.5g，分装，灭菌。202
3、5培育 35 天后无菌生长即可使用。胰酪大豆胨琼脂培育基：胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml 葡萄糖 5.Og除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调整 pH 为弱碱性，煮沸，参与葡萄糖溶解后，摇 匀，滤清，调整 pH 使灭菌后在 25C 的 pH 值为 7.2 士 0.2，分装，灭菌。麦康凯液体培育基明胶胰酶水解物 20.0g 溴甲酚紫 10mg 乳糖 10.0g 水 1000ml 牛胆盐 5.0g 除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调整 pH 使灭菌后在25的 pH 值为 7.30.2，参与乳糖、溴甲酚紫，分装 ，灭菌。麦康凯琼脂培育基明
4、胶胰酶水解物 17.0g 中性红 30.0mg 胨 3.0g 结晶紫 1mg 乳糖 10.0g 琼脂13.5g 脱氧胆酸钠 1.5g水 1000ml 氯化钠 5.0g除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解 ，调整 pH 使灭菌后在 25的 pH 值为 7.10.2，参与乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸 1 分钟，并不断振摇，分装 ，灭菌。市售成品培育基按说明书配制。革兰氏染色试剂：有商品供给，含结晶紫染剂、碘液固染剂、酒精脱色剂、复红复染剂。4.2 器材和设备无菌器皿：吸管、量筒、锥形瓶或盐水瓶等。其它器材和设备：接种针、酒精灯、玻片、细菌培育箱等。5 程序供试品供试液
5、增菌培育麦康凯液体培育基疑似菌落纯培育30351824h r42442448hr革兰氏染麦康凯琼脂平板色、镜42441872hr可疑检生化试验(IMViC)菌落形态特征有菌落生长无菌落生长报告结果报告结果报告结果5.1 样品处理及预备取样品 10g 或 10ml，用 pH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解并稀释至100ml，为 10%的试样。当样品含有抑菌物质时，应按相应物料“抽样检验规程”所规定的方法和要求予以处理，如稀释法、离心法、中和法、薄膜过滤法等。5.2 增菌培育及分别培育。5.2.1 增菌培育：取 10%的试样 10ml相当于样品 1g 或 1ml，接种于胰酪大豆胨液体培育基不
6、少于 100ml中，混匀，置 3035培育 1824 小时。5.2.2 选择分别培育：取上述培育物 1ml 接种至 100ml 麦康凯液体培育基中， 4244培育 2448 小时后，取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，3035培育 1872 小时5.2.3 结果推断：假设麦康凯琼脂培育基平板上有菌落生长，应进展分别、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；假设麦康凯琼脂培育基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌5.3 比照试验5.3.1 阳性比照试验：用阳性菌代替供试品依据 5.2 项操作，比照菌的参与量应不大于 100cfu。阳性比
7、照试验应检出大肠埃希菌5.3.2 阴性比照试验：以稀释剂代替供试液，依据 5.2 项操作，阴性比照顾无菌生长，假设阴性比照有菌生长，应进展偏差调查。5.4 鉴定试验5.4.1 菌落形态鉴定：麦康凯琼脂培育基上大肠埃希菌菌落形态特征：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形、扁平，边缘整齐，外表光滑，潮湿。假设麦康凯琼脂培育基上消灭可疑菌落时挑取菌落进展分别、纯化、染色镜检和 IMViC 试验，确认是否为大肠埃希菌。5.4.2 纯培育假设麦康凯琼脂培育基平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的外表中心，蘸取培育物，应选择 23 个以上疑似菌落，分别接
8、种养分琼脂斜面，温度 3035培育 1824hr，进展以下检查。假设平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团如呈紫黑色或有金属光泽 ，则应蘸取可疑菌团培育物少许，或重取增菌培育液分区划线接种于麦康凯琼脂培育基平板，温度 3035培育 1824hr，再选择单个疑似菌落，纯培育，进展以下检查。5.4.3 革兰氏染色、镜检5.4.3.1 以接种环蘸取无菌水于干净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的养分琼脂斜面颖培育物少许，制成均匀涂片，自然或微温枯燥，再通过火焰 23 次固定。5.4.3.2 在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色 1min，水洗。5.4.3.3 滴加碘液，媒染 1min，水洗，以滤纸吸干余水
9、。5.4.3.4 滴加 95%乙醇，严格把握时间脱色 2030s，水洗。5.4.3.5 滴加沙黄染液，复染 1min，待干后，镜检。5.4.3.6 镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌。5.4.4 生化IMViC试验5.4.4.1 乳糖发酵试验取上述斜面培育物，接种于乳糖发酵管，温度 3035培育 2448hr，观看产酸指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色，产气小倒管内有气泡，气泡无论大小 。为了避开缓慢发酵产生假阴性，也可接种 5%乳糖发酵管。绝大多数缓慢发酵乳糖的细菌，可于 24hr 消灭阳性，或适当延长培育时间。5.4
10、.4.2 靛基质试验I 取上述斜面培育物，接种于蛋白胨水培育基中，温度 30 35培育 2448hr，沿管壁参与靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性+，呈试剂本色为阴性-。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般 24Hr 即可消灭阳性结果，以无菌操作先从管中取出 1ml 或 2ml 培育液进展检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培育物再培育 24hr，做靛基质试验。5.4.4.3 甲基红试验 M 取上述斜面培育物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培育基中，温度 3035培育 482hr，于培育液中参与甲基红指示液 23 滴约每1ml 培育液 1 滴，略微摇动，马上观看，呈鲜红色或橘红色为阳
11、性，呈黄色为阴性-。5.4.4.4 乙酰甲基甲醇生产试验V-P 取上述斜面培育物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培育基中，温度 3035培育 482hr，于 2ml 培育液中参与-萘酚乙醇试液 1ml，混匀，再加 40%氢氧化钾试液 0.4ml，充分振摇，在 4hr通常在 30min 时内消灭红色判为阳性+，无红色判为阴性-。5.4.4.5 枸橼酸盐利用试验 C 取上述斜面培育物，接种于枸橼酸盐培育基斜面上，温度 3035培育 24 天，培育基斜面有菌苔生长，培育基由绿色变为蓝色时，判为阳性+，培育基颜色无变化、无菌苔生长，判为阴性-。5.4.4 结果推断：当 IMViC 试验为“- + - -”、革
12、兰氏阴性杆菌，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠埃希菌； IMViC 试验为“+ + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠埃希菌。其他状况报告 1g 或 1ml 供试品未检出大肠埃希菌。见下表：试验结果结果推断大肠埃希菌 IMViC 试验结果推断靛基质(I)甲基红(M)V-P(Vi)枸橼酸盐利用试验(C)+-典型大肠埃希菌-+-非典型大肠埃希菌+-+典型中间型-+-+非典型中间型-+典型产气菌+-+非典型产气菌6. 报告6.1 填写记录由操作人员准时收集和填写检查记录，见大肠埃希菌检查记录。6.2 问题及偏差处理操作过程中觉察结果超标或特别时，应进展分析和调查，
13、可依据“OOS 处理规程(SMP-QC-002)”进展，当 OOS 处理觉察 OOS 不成立，可参考“偏差处理规程SMP-QA-007”进展，偏差及其处理同样应当予以记录。6.3 记录审核与上交记录填写后应准时上交 QC 收发人员，按批记录的要求进展整理和审核，最终由部门负责人签字后上交质量保证部。7. 留意事项7.1 贵重物料或物料量本身较少时，检验量可依据实际需要予以采集和取用。7.2 样品处理时的温度及培育基的温度均不得超过 45。7.3 供试液配后应在 1 小时内接种。7.4 应在无菌操作台上以无菌操作的要求进展。7.5 阳性试验应在阳性间生物安全柜中进展。8. 附件无。9. 派生记录R-SOP-QC4-010-01 大肠埃希菌检查记录10. 相关文件1、SMP-QC-002 OOS 处理规程2、SMP-QA-007 偏差处理规程版本号.00生效日期2023.12.01变更缘由、依据及具体变更内容依据 2023 版药典修改操作规程11. 变更记录
