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1、 新药名称、选题目的与依据及国内外有关研究现状的综述rhBMP-2国内外有关研究现状的综述一. 新药名称1.1. 制剂品名 正式品名: 重组人骨形态发生蛋白-2 英文名称: recombinant human bone morphogenetic protein-2(rhBMP-2) 汉语拼音: Chong Zu Ren Gu Xing Tai Fa Sheng Dan Bai-2 商品名称: 重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP-2)1.2. 命名依据 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，简称BMP)是本世纪60年代由美国科学家M. R. Urist (1
2、965)首先发现并命名的已沿用几十年，得到世界各国的公认。1965年M. R. Urist成功地用脱钙骨基质(decalcium bone matrix，简称DBM)在肌肉内诱导异位成骨，并预言DBM中含有一种特殊的蛋白，经对DBM进一步分离提纯得到一种活性蛋白质，这种活性蛋白质具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨组织的能力，因此被命名为骨形态发生蛋白(BMP) （Urist, M. R. 1965）。本制剂中的主要原料药是一种利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2的重组基因工程产品，因而命名为“重组人骨形态发生蛋白-2 (recombinant human bone morp
3、hogenetic protein-2，简称rhBMP-2)”（Wozney, J. M. et al., 1988）。二. 选题目的与依据 在临床医学上大面积骨缺损以及某些难愈合性骨折是平时和战时常见的创伤性骨科疾病。这些骨损伤一般很难自行修复愈合。对此，过去常采用自体骨或异体脱钙骨基质以及某些生物材料进行移植修复。在这种情况下，骨缺损修复的速度、效率、修复骨的抗张度以及由此带来的免疫排斥反应等都是治疗过程中不可避免的问题。自从骨形态发生蛋白(BMP)发现以来，它在这方面的用途受到了普遍重视。BMP是一类酸性多肽，它广泛存在于各种动物的骨组织中。目前已从多种动物的骨组织中提取分离到BMP（K
4、ubler, N., et al, 1993, Takaoka, K, et al, 1993）。BMP的主要生物学功能是诱导组织中未分化的间充质细胞不可逆地分化形成新的软骨组织和骨系细胞（Sato, K., et al, 1984）。将BMP直接埋植于小鼠股部肌肉陷窝内，可以在植入区内导致新骨形成。另外，也可以在骨髓腔或骨膜下植入BMP，使局部产生新生骨痂。诱导新骨形成是BMP有别于其它骨代谢生长因子的最根本一点，这就决定了BMP在骨缺损修复和骨折愈合的治疗中有着不可取代的应用价值。动物实验研究发现， BMP对于多种动物模型的大面积骨缺损修复具有明显的促进作用。BMP的另一个用途是加速骨折愈
5、合，尤其是对于某些特殊类型的骨折，如干骺端处的骨折、老年人骨折以及山黎豆中毒时的骨折等等。在这些情况下，骨折部位不易形成骨痂，从而影响骨折愈合。许多动物实验表明，BMP可以促进骨损伤部位的骨痂形成，加速骨折愈合（Johnson, E.E.,et al.1988,Wozney, J.M. et al., 1988）。临床上应用BMP来促进某些大面积骨缺损和难愈合性骨折的修复愈合，已有成功的报道。可以肯定，BMP在这一领域里有着十分乐观的应用前景（Urist, M. R., et al, 1979，白孟海等, 1995）。 自然界中BMP主要分布于骨组织中，但其含量甚微，尤其人骨BMP的来源更是有
6、限。从牛、猪、羊、兔、鼠、猴和人等不同动物来源的BMP有较高的同源性，具有跨种诱导成骨能力，从动物骨质中提取的BMP也能在人体内诱导骨质生成，因而近年来已有一些将动物来源的BMP试用于临床的报道。但是，动物来源的BMP毕竟不是人类自身的蛋白质，尽管其免疫原性弱，在人体内还是会引起一定的免疫反应，而且它与人类自身的BMP在诱导成骨作用上可能不尽相同。因而，在临床上应用人BMP（human BMP，hBMP）应是最理想的。但是人新鲜骨质来源有限，难以满足提取hBMP的需要。无论从动物还是从人的骨质中提取BMP，步骤繁杂，各批提取物的纯度和活性常不相同，质量难以保证，而且骨质中的BMP含量很少。因此
7、，利用基因工程技术获得能满足临床应用所需要的BMP是唯一可行的方法。自1988年以来，国内外部分实验室相继开展了BMP分子生物学的研究。到目前为止，人们研究发现BMP家族有21个成员，除BMP-1不是转化生长因子-（transforming growth factor-,简称TGF-）超家族成员外，其它BMP-2BMP-21都属于这一超家族成员（Bessho, K. , et al., 1992），并已先后克隆了7个人BMP的基因，即BMP-1BMP-7，其中BMP-1是一种蛋白酶，BMP-2BMP-7因含有7个高度稳定保守的羧基末端半胱氨酸而被认为属于TGF-超基因家族成员， 它们无论在基因
8、或蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似，并存在于去矿物质骨的提取液中。在已克隆的7个hBMP成员中，除BMP-1仅能诱导软骨组织形成外，其它6种hBMP在单独应用时均能诱导软骨和骨形成，其中hBMP-2的诱导成骨活性最强，其它6种hBMP可能与hBMP-2有协同作用（Wang, E.A. et al., 1990, Sampath, T.K. et al., 1992, Cook, S.D. et al., 1994）。因此，近年来人们集中了很大的精力对BMP家族中hBMP的基因表达、结构与功能、生物学活性及其骨修复能力进行了深入的研究。国外研究表明，rhBMP-2基因已在部分工程细胞株
9、中获得了高效表达，如真核细胞的非洲绿猴肾（COS）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等，但其rhBMP-2在真核细胞中的表达量实在太低，产量远不能满足临床应用的需求。因而只有利用大肠肝菌作为宿主细胞， 才能大量地表达和生产rhBMP-2，以满足实际需求。虽然rhBMP-2在大肠杆菌中的表达量很高，但它是以无活性的包涵体形式存在，在应用上存在一个复性的问题，而至今仍未找到一种比较廉价的复性方法，因此迄今为止尚未见有比较大规模生产成功的报道（Wozney, J. M. et al., 1988, Takaoka, K., et al. 1993, 赵明 等，1994）。 鉴于BMP的这种诱导骨形成的特殊
10、作用及其可观的临床应用前景，国内外一些研究部门和生物技术公司已瞩目BMP，并开始投入大量资金进行开发研究。据有关报道，重组BMP生物药品在美国将于2003年获得批准上市，其市场开发潜力将达到10200亿美元。据有关统计，我国每年需要植骨治疗的骨科和口腔科病人约有10万人左右，如果rhBMP-2作为一种用于骨损伤修复的新生物制剂，能得到充分的推广应用和潜力开发，必将产生巨大的社会和经济效益。如BMP能在神经系统、肾、心、肺、眼等器官方面获得临床应用，则BMP带来的综合效益将是空前的。三. 国内外有关该项目研究现状 早在1965年，美国科学家M. R. Urist就发现，将牛的脱钙骨基质明胶植入小
11、鼠的肌肉内，可以诱导形成新的软骨组织和骨系细胞。当时他认为在骨基质明胶 (bone matrix gelatin，简称BMG)中可能存在某种有骨诱导活性的特殊蛋白质。经过20多年的研究，他和同事们证明了在骨基质中的确存在一种骨诱导活性蛋白，并命名为骨形态发生蛋白。目前，人们已从多种动物的骨基质中分离得到BMP。研究发现，BMP是一类酸性多肽，能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨，从而导致新骨形成。BMP所具有的这种独特的诱导成骨活性，决定了它在修复骨缺损和促进骨折愈合等方面可以发挥重要作用。近年来，有人先后克隆了7个人BMP基因，并且成功地在多种宿主细胞中获得表达，这无疑为BMP的分
12、子结构与功能的研究以及临床医学的应用奠定了基础。 (一)BMP的生物化学1. BMP的分离纯化1.1 组织来源及分布： BMP广泛分布于各种动物的骨组织中，如牛、猪、鼠、猴和人等，其含量很少，每公斤湿骨中含1mg左右。内源性BMP在骨内的分布是不同的，骨皮质的含量高于骨松质的。骨基质中的BMP大部分是与胶原结合在一起，少部分或与骨盐结合，或为游离状态。提取BMP时多采用动物的长干骨。此外，动物的牙本质中也含有BMP。在某些骨肿瘤中，如人和鼠的骨肉瘤，也发现含有丰富的BMP。免疫组化证明，骨外组织BMP的含量相对甚少。骨内BMP可能来源于骨母细胞和间充质细胞。BMP随着动物年龄的增加，其含量也逐
13、渐下降。采用放射免疫技术和单克隆抗体酶标检测方法，发现血清中BMP的含量约为100ug/100ml，儿童的含量远高于成人的。BMP在各种骨病患者的骨和血清中的含量也不同，例如佝偻病患者的骨基质不能钙化，主要在于血清中BMP的含量少；坏血病主要是胶原的干扰，故BMP的活力和骨基质的钙化出现问题；山梨豆中毒的骨折不连接，主要在于缺乏BMP；绝经后骨质疏松也与缺乏BMP有关，而Paget病则与BMP的含量增大有关；在骨肉瘤，非但肿瘤组织中的BMP含量交稿，而且血清中BMP和BMP抗体的含量也异常。当骨组织受到损伤时，BMP迅速出现含量的增加和活性的增强（Nakase T, et al, 1994）。
14、因此，人们可以根据体内BMP的分布和含量，对一些遗传病和骨科疾病进行正确的诊治。1.2 分离与纯化： 国内外许多实验室对各种动物骨中BMP的分离和纯化做了大量的研究和探索。归纳起来，这些方法大体可概括为3个主要的过程，即：BMG的制备、萃取和层析。1.2.1 BMG的制备：取新鲜长骨（或-20冻存的），去除所有软组织、软骨及骨髓，经液氮冰冻后，粉碎成1mm3大小的颗粒，进行脱脂和脱骨盐处理，然后在氯化锂等作用下使脱钙骨基质转变成不溶性的BMG，同时也可去除大部分可溶性的非胶原蛋白。1.2.2 萃取：不溶性的BMG中含有与胶原蛋白结合的BMP，可用6M尿素溶解BMG，使结合的BMP解离出来。为了
15、避免BMP活性的破坏，可加入一些保护剂，如乙基马来酰亚胺(NEM)和苯甲基磺酰氟(PMSF)。滤除不溶的沉渣后，纯水透析，离心收集到的沉淀物即为有诱骨活性的BMP粗提物。然后，再用尿素和盐酸胍进行反复多次的溶解、透析，最后进行超滤。到此， BMG中绝大部分可溶性的及不溶性的杂蛋白已被去除。1.2.3 层析：部分纯化的BMG萃取成分可采用色谱层析技术进一步纯化。最常用的方法是羟基磷灰石(HA)层析，BMP可以吸附在HA上，在梯度洗脱中有活性的BMP组分可被0.22M磷酸缓冲液所洗脱。其它常用色谱方法，如离子交换色谱(CMC、DEAE-52)、凝胶过滤色谱(SepharoseCL-6B、Sepha
16、dexG-250、Sephacryl-200)以及亲和层析色谱(Sepharose-肝素、Sepharose-刀豆素)等，它们在BMP的纯化中都可获得较满意的结果。在亲和色谱中BMP作为一种糖蛋白能以C-H键和疏水键与亲和配体结合。这两种结合键可分别被-甲基甘露糖苷和乙二醇洗脱。反相HPLC可分离得到更高纯度的BMP。 由此可见，动物骨BMP的分离纯化步骤较多，整个过程也较为复杂繁琐。目前还缺乏一种较为简便有效的分离纯化方法和步骤。2. BMP的理化性质 2.1 分子量及等电点： 关于BMP的分子量以及BMP复合体中各种不同分子量蛋白之间的关系一直是BMP生化研究的热点之一。不同动物的BMP的分子量有所不同，人骨、
