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1、细胞筛选一嘌吟霉素（一）确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌吟霉素合适浓度未知时，需进行滴定， 或制定针对那种细胞的嘌吟霉素杀菌曲线。一般而言，嘌吟霉素浓度范围在2-10微克/毫升 时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%80%时），用新鲜无抗无血清的 培养基制成1.5X105个/ml的细胞悬液。3. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5X104个），然后向 每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在
2、固 定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。）4. 第二天用嘌吟霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, & 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替 换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意： 对于多数细胞种类而言，过量的嘌吟霉素能引起许多非必需的表型的反应。）5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天 即每隔两天）更换含嘌吟霉素的新鲜无抗无 血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。6. 在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生 存时间而定，大 概需3到14天。在所需时间之后，嘌吟霉素的导致
3、所有细胞死亡的最小浓 度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。（二）转染细胞1. 第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80% 的密度，CO2孵箱过夜培养。2. 第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8 “ g/ml。将已 经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基， 加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞 有毒性。这时，可以用Protamine Sulfate代替Polybre
4、ne）（三）筛选细胞1. 病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。2. 如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48 小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入 Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果 Polybrene没有毒性，还可以加入 puromycin，作为puromycin是否有效的对照。3. 以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培 养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。4. 待抗性细
5、胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿 内。5.60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。6. 10cm 培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低鉴定清楚 后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感 染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不 存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。二 G418（一）确定最优筛选浓度由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽 相同，所
6、以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。1. G418的配制：取1g G418溶于1ml 1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml （使 G418终浓度为0.1g/ml ,HEPES终浓度为100mmol/L）,过滤消毒，4度保存。 HEPES的 化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N -a-hydroxythylpiperazine-N - ethanesulfanic acid ）， 分子量238.31,是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对 细胞无毒性作用。1mol/L HEPES的简单配置：HEPES 23. 83g，溶解于80ml的双蒸水中，
7、用10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4,定容至100ml，0.22um小滤器过滤。HEPES使用 终浓度为10-50mmol/L。2.制备筛选培养基：在 100ug/ml 1000ug/ml 范围内按 0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml， 500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml， 900ug/ml、1000ug/ml 浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成筛选培养基。心得：由于特性明确的细胞系G418 的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染 NIH3T3细胞
8、，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是 200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。3. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）4. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%80%时），用新鲜无抗无血清 的培养基制成1X104个/ml的细胞悬液。5. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1X103个），然后向 每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养。（这样做是为了保证在固定细 胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。）汇合度：实际
9、上就是指细胞占培养表面的比例, 如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% !6. 培养6小时左右开始加药。加筛选培养基筛选：吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次， 每孔中加入不同浓度的筛选培养基适量。7. 换液：每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天即每隔两天）更换筛 选培养基一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。有死细胞勤换液，可 以减少对存活细胞的影响。8. 确定最佳筛选浓度：在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细 胞的生长率和一般生存时间而定
10、，在筛选1014天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度 即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现 这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418 的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天 就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最 佳筛选浓度。（二）转染细胞1. 第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80% 的密度，CO2孵箱过夜培养。2. 第二天：准备3ml无
11、抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8“g/ml。将已经 制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基， 加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用Protamine Sulfate代替Polybrene)3. 转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70%汇合时按1： 4密度传代，继续培养, 待细胞密度增至50%70%汇合时开始筛选。(三)筛选细胞1.加G418：去掉培养液,PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基(无 抗无血清)(实 际应用
12、时可以比最佳筛选浓度高一级别)。2. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。当有大量 细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选1014天后，可见有抗性的克隆出现, 停药用完全培养基培养。3. 待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个 /10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入 到48孔中增殖。4. 单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA,做RT-PCR检测目的基因是否存在。 典型贴壁细胞平板密度塔养板大小生长面和(cm2)大约细胞数培养基容和(E)组织培养皿(pEOmm
13、)286. 6X1O55-6石孔培养板(tp 35mm)9.53X 1Q51-212孔塔养板(p 22.6mm)41. 3X1O50. 5-124孔土口养板(p 8mm)0. 50. 6X1O50. 25-0. 5作用机制：嘌吟霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷 类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有 效作用大肠杆菌。嘌吟霉素作为氨酰-tRNA分子3,末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并 掺入到延伸的肽链中。但是嘌吟霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导
14、致蛋白 质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌吟霉素的不成熟多肽。抗性基因：对嘌吟霉素的抗性取决于编码嘌吟霉素N-乙酰转移酶(PAC)的Pac基因，遗传工程研究使用的Pac 基因分离自嘌吟霉素产生菌Streptomyces alboniger。最普遍应用：1)嘌吟霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌吟霉素在细 胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac 基因2)在某些特定情况下，嘌吟霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。化学特性: 化学名称：3 (a -Amino-p-methoxyhydro ci
15、nnamamido)- 3deoxy- N,Ndimethyladenosine2HClCAS No.： 58-58.2,分子式：C22 H29 N7 O5 .2HCl,分子量：544.43 g/mol纯度：98% (HPLC)，易溶于水5-50mg/mL, -20度保存。应用浓度：哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-lOg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125g/mL。使用嘌吟霉素筛选大 肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。使用步骤：(哺乳动物细胞筛选)嘌吟霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株，仅作参考
16、)为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌吟霉素至 关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线(kill curve)。(1) 24孔板内以58 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育 过夜；(2) 准备筛选培养基-含不同浓度嘌吟霉素的新鲜培养基(如0-15gg/mL，至少5个梯度)；(3) 细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；(4) 约2-3天更换新鲜的筛选培养基；(5) 每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌吟霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。(6) 最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛
