革兰阴性杆菌的主要耐药机制

《革兰阴性杆菌的主要耐药机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《革兰阴性杆菌的主要耐药机制（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、革兰阴性杆菌的主要耐药机制今天我给大家讲解的是革兰阴性杆菌的主要耐药机制。首先我们复习一下细菌耐药性的分类,细菌耐药性的分类主要分为天然耐药和获得性耐 药，天然耐药是指某微生物种的所有菌株具有相同的内在特性，由染色体介导，通常直接传 给子代，是该菌的特征，可以用于鉴定细菌。例如铜绿假单胞菌，对复方西诺敏是天然耐药， 克雷伯菌对氨苄西林天然耐药等等。而获得性耐药是指发生在一个菌种或菌属中的部分菌 株，发生的比例会随时间的变化而改变，通常由可转移的DNA比如质粒、转座子、整合 子等介导，并可水平传播，也可以垂直传播，在缺少抗菌药物的选择压力时，耐药性有时会 消失。而获得性耐药是我们今天讲解的重点。

2、细菌对抗菌药物的耐药性主要分为下面四种。第一产生灭活酶；第二，细胞通透性的变 化，特别是细胞膜通透性的变化；第三，主动泵出；第四，对抗菌药物作用靶位的修饰改变。 而前面三种主要是革兰阴性杆菌的耐药机制。最后一种常常表现在革兰阳性菌中。我们今天 讲解的也是以前三种耐药机制为主。首先我们讲解一下灭活酶。这是一张所有耐药机制的简易图，我们可以看到右上方有两个耐药机制，第一个是由于 某孔蛋白兴奋性的障碍导致抗菌药物不能够顺利地通过细菌的细胞膜，而直接在细胞膜外游 走，不能发挥它的作用。另一个就是泵出机制，由于细胞膜上的泵将细胞膜内的抗菌药物泵 出细胞外，使抗菌药物在细胞内的浓度大大降低，本图右下方所指

3、的就是灭活酶的作用机制， 细菌对进入细胞内的抗菌药物有两种灭活酶的作用方式，第一是将抗菌药物水解掉，第二是 将抗菌药物进行修饰或者将其自身的靶位进行修饰，使抗菌药物不能发挥正常的作用。这张 图的左上方指的是细菌的细胞对于抗菌药物作用的靶位发生了改变，因此，抗菌药物不能够 顺利地结合在作用的靶位上，从而失去了自身发挥作用的能力。左下方这一张图表示的是抗 菌药物进入细胞内，应当通过正常的途径发挥其作用，而此时细菌对因此产生一种常用通路 使抗菌药物不能发挥其作用，以上机制是细菌的主要耐药机制的简介图。下面我们介绍细菌的产酶机制。我们复习一下灭活酶的定义，灭活酶是指细菌产生一种 或多种水解酶，或者是钝

4、化酶，来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失 去活性，是最常见的耐药机制。这类酶主要分为B 内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶氨基糖 苷类钝化酶、喹诺酮类DNA旋转酶或拓扑异构酶。下面，我们介绍一下B 内酰胺酶。在介绍B 内酰胺酶之前我们可以了解一下微生物实验室检测B 内酰胺酶的一些 实验方法，对于简单的阳性菌的B 内酰胺酶，我们可以用B 内酰胺酶纸片协同检测， 这在其他的讲解中会为大家介绍到。而这里介绍的主要是通过耐药表情的方式进行检测。这 张图片显示的是纸片协同法检测B 内酰胺酶。我们首先可以看到在纸片上标注了 CAZ 的纸片是单剂量含有头抱他啶的纸片，而这个白纸片上面我们加了一些酶

5、抑制剂。当纸片的 距离由近渐远的时候那么它之间的协同就会减弱，这个时候我们就知道抗菌药物以及酶抑制 剂的作用可以将这个细菌的耐药性降低，因此，这是一种检测B 内酰胺酶的比较适合临 床应用的方法，叫做纸片协同法。这一种检测B 内酰胺酶的方法是三维试验法，这是一种经典的检测酶的方法，它可 以检测大部分B 内酰胺酶，下面我们简要介绍一下它的试验原理。首先我们在平皿中均 匀地涂布ATCC25922细菌，通常的浓度是0.5个单位，之后我们再平皿的正中间贴上抗生 素纸片，检测不同的酶贴的抗生素纸片不同，比如超广谱B内酰胺酶我们贴的是三代头 抱，而头抱菌素酶我们贴的就是头抱西丁，如果是碳氢酶烯酶或者是菌属酶

6、之类的，我们就 可以贴美罗培南等碳氢酶烯类的药物，贴好纸片后我们在距离纸片5毫米的位置上打一个 细长条的口，这个口三度和一般波片的宽度类似，在打好孔之后，我们将孔内的纸，用小凹 槽条给它挖掉，形成一个凹槽，在这个凹槽内滴入，这个凹槽叫做加样槽，我们在这个加样 槽内滴入我们带待测的霉素滴液，当滴入霉素滴液后，酶就会沿着这个纸由中心向四周扩散， 形成一个酶的分布区，同时，由于纸片的抗菌药物的浓度由高到低，也形成一个扩散区，当 它们两个相交的时候，这个酶，带特指的酶就作用于细菌药物，如果它产生了 B 内酰胺 酶，它就会将我们待测的，它就会将我们放置在中间的抗菌药物水解掉。此时，由红色和黑 色交叉的区

7、域就形成了一个没有抗菌药物的区域。因此，底部的25922菌就会沿着这个区域缝内生长，形成一个矢状菌苔，一旦出现了矢状菌苔，就说明我们在加样槽中加的待测菌产 生了我们需要的检测的B 内酰胺酶。在了解了检测B 内酰胺酶的方法后，我们再复习一下B 内酰胺酶的简单分类。 B 内酰胺酶分为400多种，目前我们将它主要分成染色体介导和质粒介导的两大类。通 常这两大类中包括了所有的B 内酰胺酶，而富有代表性的就是头抱菌素酶、碳青霉烯酶 以及我们经常所说的超广谱B 内酰胺酶。下面我们下简要介绍一下头抱菌素酶，它的分子量大约为39000左右，其等电点大多是 大于9.0,能分解三代头抱菌素及单环酰胺类抗菌药物，不

8、被B 内酰胺酶抑制剂所抑制， 但可以被氯唑西林所抑制。产生该酶的菌包括大部分肠杆菌科细菌，如肠杆菌属的某些菌属， 弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根式菌、普鲁菲登式菌以及粘质沙雷菌等等。根据表型可以将头 抱菌素酶分为低基础水平持续表达，低基础水平和高诱导产生，高基础水平持续表达等。下面这张图我们就以实例给大家介绍阿斯菌酶、B 内酰胺酶以及其他表型的酶类测 定。首先我们看一下右上方的这一张图，待测14号菌的图片。我们中间知道纸片是头抱曲 松，是一个三代头抱，在它上北下南左西右东的这四个方向上我们拉了四个槽，在这个槽内 我们加了 14号菌的酶粗提液，上面这个是没有加任何抑制剂的酶粗提液，右边是加了克拉 维

9、酸和酶粗提液，左边是加了氯唑西林酶粗提液，而下方是加了酶粗提液以及克拉维酸和氯 唑西林两种酶抑制剂。对于阿斯菌酶的检测而言，我们前面讲过，该酶不被克拉维酸所抑制， 但是被氯唑西林所抑制，因此我们在看这张图的时候，会清晰地表达。一个什么概念呢？就 是上面有酶粗提液的菌，单加酶粗提液的时候，14号菌产生的酶可以将头抱曲松水解形成 矢状苔，而加入了克拉维酸的这边，右边，虽然加了克拉维酸，但是它并没有把酶粗提液的 酶抑制住，因此矢状苔仍然存在，而在左侧加了氯唑西林这一边酶粗提液当中的酶成份被氯 唑西林所抑制，因此，头抱曲松即使发挥其作用，对于25922标准菌株形成了非常严的切记， 因此14号待测菌产生

10、的就是阿斯菌酶。另一类B类酰胺酶是我们最常听到的超广谱B 内酰胺酶，超广谱B 内酰胺酶是质粒介导的能水解头抱他啶、头抱噻肟等亚氨基B 内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗 生素的一种酶类。并可被克拉维酸等B 内酰胺酶抑制剂所抑制。在分子生物学分类中， 超广谱B 内酰胺酶属于A类酶，而在Bush分类中属于2 be类酶。那么回到上面一张图片，下面我们看左上方的这张图，刚才讲到，在最上方的这个加样 槽中，我们紧加入酶粗提液，而在右边，我们加入了克拉维酸，在对8号待测菌的酶型检测 中显示到我们在加入左侧加入氯唑西林的过程当中，这个酶并没有被氯唑西林所抑制，而右 侧再加入克拉维酸的过程中，8号待测菌产生的酶被

11、克拉维酸所抑制，因此，矢状苔消失， 形成了克拉维酸抑制阳性试验，因此8号待测菌的表现酶型就是超广谱B 内酰胺酶。超广谱B 内酰胺酶的分类主要分为经典超广谱B 内酰胺酶和其他类型的超广谱 B 内酰胺酶，所谓经典超广谱B 内酰胺酶就是人们最早发现的TEM型和SHV型， 其次随后发现的在CTX M型酶和PER型酶中此类酶都是高产B 内酰胺酶，形成 了非常耐药的菌株。在2009年CRSI的标准更新中，我们可以注意到，目前CRSI已经不推荐在临床报告 中报告BSCR也就是超广谱B 内酰胺酶，因为我们在临床表型中通常会发现B 内 酰胺酶阳性甚至是超广谱B 内酰胺酶阳性的情况下，部分三代头抱治疗仍然有效，因

12、此， CRSI修订了所有三代以上头抱的判断标准。不论是KD法还是MIC法，这也就意味着在 今后的报告中，我们可以不报告BSCR，而只报告具体的抗菌药物的解释结果。但是， BSCR仍然是我们对于耐药监测的重点监测内容，它可以有助于我们防止院内感染的发生。除了阿斯菌酶和ESBL酶之外，我们还可以发现另外一种酶，如我们左上方这张图所 显示的，在单独加入克拉维酸或者是氯唑西林后，两种酶都不能将待测菌的酶抑制住，但是 当我们下方同时加入克拉维酸和氯唑西林时，该酶将被抑制住。这种表型我们通常称为超超 广谱B 内酰胺酶，也就是SSBLs，但是这种酶型在临床上并不常见，此外，还有一种 酶型就是我们右下方这张图

13、所显示的，即便是我们将克拉维酸和氯唑西林两种酶抑制剂都加入到待测槽中，仍然不能够将待测菌产生的酶抑制住，而这就说明，这个菌产生了另外一种B 内酰胺酶，通常我们首先想到就是其他的碳青霉烯酶，如金属酶。下面我们就为大家继续介绍另一种重要的B 内酰胺酶，碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是 指所有能明确水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗菌药物的一类B内酰胺酶。碳青霉 烯酶主要分为天然来源的碳青霉烯酶和获得性的碳青霉烯酶，天然来源的碳青霉烯酶主要由 嗜麦芽暂时养单胞菌形成，而获得型的碳青霉烯酶根据分子分类通常分为A类酶、B类 酶和C类酶。下面我们将以实例逐个的介绍一下各类酶的检测以及判定。A类酶经常分类属于II

14、 F型，具有四氨酸位点，可以被克拉维酸抑制。包括阴沟肠杆 菌、绵质沙雷菌，由染色体介导的NMC A，SMEe酶等等，以及质粒介导的KPC I 和KPC II酶，从氯甲单胞菌中质粒介导的GES II酶，A类碳青霉烯酶都是青霉素 酶，对亚胺培南的水解活性强于美罗培南，可以引起青霉素类、氨曲能，碳青霉烯类抗菌药 物的耐药。B类酶就是我们通常所说的金属酶，这张图片就显示的金属酶的测定，金属酶 分类属于III型，金属酶不仅对B 内酰胺酶的抑制剂敏感性差，而且能够水解包括碳青霉 烯酶在内的几乎所有的B 内酰胺类的抗菌药物。金属酶分类属于III类酶，多数金属酶对 亚胺培南的水解能力强于美罗培南，但蜡样芽抱杆

15、菌II酶和III D中的ASDL 1对美罗培 南的水解能力更强。金属酶对氨曲能的水解能力都非常弱。最后一类碳青霉烯酶是C类酶， 也就是我们通常所说的OSA系列酶。在布氏分群中属于II B类，OSA型碳青霉烯酶对 亚胺培南的水解活性很低，对头抱他啶、头抱噻肟、氨曲能水解活性也很弱，除OXA 23 外，其他酶能被克拉维酸所抑制。OXA碳青霉烯酶基因可位于质粒或染色体上，或者定 位于I型整合体的基因盒中。具有向其他菌种转移的能力。我们回到金属酶的测定，首先我 们看到左边是属于一种典型的金属酶测定的test条，上方是单剂亚胺培南，下方是亚胺培 南加EDTA，当它们两个读数相差3个剂试度也就是三倍时，显

16、示金属酶检测阳性，如果实 验室没有这种金属酶测试条，我们可以通过更简单的方法，也就是说纸片测定法，在纸片测定法中我们要注意，通常我们选择的是亚胺培南纸片进行测定，上面这张亚胺培南是III剂亚 胺培南，下面这张亚胺培南是加了 EDPA的亚胺培南，当两者的直径大于5毫米 时，显 示金属酶测定为阳性。另一种碳青霉烯酶称作A类酶，典型代表是我们最近经常听到的KT金万酶。检测KP菌酶最经典的方法在CRSI的标准测定上会给大家介绍。首先我们注意右边 的这幅图，在平皿中均匀以涂布0.5个麦氏单位的大肠埃希标准菌株ATCC25922，在碟子 正中间贴一个10微克含量的亚胺培南，此时我们不再挖槽，而将待测菌从远端向，从纸片 外缘向平皿边缘划线，划好线后，我们将平皿放入35度培养过夜。在判读结果时，亚胺培 南在抑菌圈内出现待测菌矢状生长者为产碳青霉烯酶菌株。比如我们看到的左侧和右侧两个 待测点都是高度怀