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1、酶法处理烟叶碎片制备烟草浸膏庞登红1，李丹2，熊国玺3，王娜3，陈守文1*，华中农业大学农业微生物国家重点实验室，湖北武汉430070湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北武汉430051武汉黄鹤楼天然香料有限公司，湖北武汉430040EMAIL:摘要：为了实现烟叶碎片的再利用，本文开展了中性蛋白酶处理烟叶碎片提取物制备烟草浸膏的工艺研究。优化了pH调节剂、酶添加量、酶处理温度和酶处理时间，优化条件为：pH调节剂为1mol/L氢氧化钠溶液，中性蛋白酶添加量为6.0g/L，酶处理温度为40C,酶处理时间为4h。与对照比较，酶法浸膏能改善烟气状态，降低刺激性，减少残留；烟叶碎片提取物中氨基酸含量增
2、加了211.1%-316.7%，还原糖含量增加了8.0%-8.8%，蛋白质含量减少了11.2%-43.0%；且此酶法浸膏中含吡喃和吡嗪环状小分子结构的香气物质含量增加了5.5%，高分子醇、酸和烷烃含量减少45.5%，以及尼古丁含量降低了5.5%。关键词：烟叶碎片；烟草浸膏；中性蛋白酶；气质分析中文分类号：Q814.9Tobaccoextractmadefromtobaccofragmentswithenzyme1. PANGDeng-hong(1),LIDan(2),XIONGGuo-xi(3),WANGNa(1),CHENShou-wen(1)StateKeyLaboratoryofAgri
3、caturalMicrobiology，HuangzhongAgricaturalUniversity,Wuhan,430070,ChinaTechnologyCenterofChinaTobaccoHubeiIndustrialCO.,LTD,Wuhan,430051,ChinaWuhanHuanghelouNaturalFlavoursCO.,LTD,Wuhan,430040,ChinaAbstract：Forrecyclingtobaccofragments,thetechniqueabouttobaccoextractfromtobaccofragmentswithneutralpro
4、teinasewasstudied.Theenzymetreatmentconditionswereoptimized,includingpHregulator,enzymeconcentration,treatmenttemperatureandtreatmenttime.Theoptimalconditionswereasfollows:theextractpHregulatorwas1mol/Lsodiumhydroxide,6.0g/Lneutralproteinase,40Cfor4h.Comparedtothecontrol,theenzymaticextractcouldamel
5、ioratestateofthesmoke,reduceitsthrillandhangover.Itsfreeaminoacidcontentwassteppedup211.1%-316.7%andreducesugarcontentwereimprovedof8.0%-8.8%,whiletheproteincontentwasreducedby11.2%-43.0%.Thecontentsofitsaromacompoundwithring-likestructuresuchaspyranandpyrrowereincreasedof5.5%,whilethecontentsofitsm
6、acromoleculecompoundssuchasmellowandparaffinwasreducedby45.5%andnicotinweredecreasedof5.5%.Keywords:TobaccoFragments;TobaccoExtract,NeutralProteinase;GC/MSAnalysis作者简介：庞登红（1983-）,男，重庆潼南人，华中农业大学微生物国家重点实验室发酵工程在读硕士，主要从事生物技术制备烟用香精香料的开发研究工作。通讯作者：陈守文（1968-），男，湖北黄石人，教授，博士生导师，主要从事微生物发酵的研究。Email:我国烟草植物的种植面积和
7、产量均居世界首位，每年烟叶产量274.4万吨，在烟草复烤、运输、储存和卷烟生产加工等过程中，有大量的烟叶碎片产生。因此，如何将烟叶碎片变废为宝，已成为一个丞待解决的问题1-4。邱承宇等在混合烟丝中加入不同比例的烟叶碎片，既提高混合烟丝的填充值、降低烟支单重、减少卷烟焦油量的产生，且对感官质量无太大影响，又充分利用烟叶原料，为卷烟降耗、降焦工艺提供了一种新的参考方法5;谭新良等将烟叶碎片通过制浆方法生产烟草薄片，但未见烟叶碎片制备烟草浸膏的报道。烟草浸膏作为烟叶碎片的高附加值产品，解决了烟叶碎片制备烟丝对高品质的要求和烟叶碎片制备烟草薄片低效益的问题。烟草浸膏在卷烟中具有丰富烟香，体现烟草本香的
8、作用，但由于烟草浸膏中蛋白质含量高，使得其在卷烟中具有增加刺激性和残留的缺点。中性蛋白酶作为一种水解酶，其对烟草中蛋白质的降解作用最为明显。因此，本文选用中心蛋白酶处理烟叶碎片制备烟草浸膏。1材料和方法1.1材料1.1.1材料烟叶碎片（武汉卷烟厂）；五元空白烟丝（武汉卷烟厂）；中性蛋白酶（杭州中香化学有限公司5万U）；二氯甲烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（AR天津市风船化学试剂科技有限公司）；氨水（AR广东光华化学有限公司）；纯净水（武烟自用纯净水）；茚三酮、正丙醇、正丁醇、乙二醇、醋酸钠、冰醋酸、亮氨酸、异丙醇、抗坏血酸、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸试剂、酒石酸钾纳、亚硫酸
9、钠、苯酚、无水硫酸钠、磷酸氢二甲（AR国药集团化学试剂有限公司）。1.1.2仪器TRACEGCUltra-DSQH型气-质联用仪（美国热电科技有限公司）；数显电热恒温干燥箱（武汉鼎立烘箱炉业有限公司）；旋转蒸发器RE-5IAA（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D循环式真空泵、电热套（巩义市予华仪器有限公司）；数显恒温水浴锅HH-6（常州澳华仪器有限公司）；冰箱（博西华家用电器有限公司）；猴头喷雾器；打烟机（德国FABRIQUEENALLEMAGNE公司）。1.2工艺和方法1.2.1酶法浸膏的制备烟叶碎片浸膏的制备工艺如图1其中，对照样为不用中性蛋白酶的处理样。图1烟叶碎片浸膏的制备工艺流程Fig
10、ure1Thetechniqueflowchartoftobaccofragmentextract1.2.2烟草浸膏的评吸评价准确称取0.04g烟草浸膏至5ml小烧杯，加1.60g蒸馏水稀释，用喉头喷雾器均匀喷洒于40g五元空白烟丝，装入封口袋，吹气使封口袋鼓起，将袋口封住，放在烘箱中80C烘0.5h,打烟给专业评吸人员评吸。评吸打分参照郑州烟草院单体/香精作用评价原始记录表。评分表格如下：表1烟草浸膏评吸表Table1Thesense-somokingtableofthetobaccoextract香气特征香气质杂气香气量烟气特征口感特征透_劲_浓细腻柔刺激干燥回_余发头度和程度程度程度甜味
11、性上表中每一评分项目的分值从1.0到5.0,每0.5分一个档次。评吸时对每一项进行打分,最后算其总分。1.2.3还原糖、蛋白质和氨基酸测定采用DNS法测定还原糖含量、茚三酮比色法测定游离氨基酸含量，考马氏亮蓝法测定蛋白质的含量8。取100g烟叶碎片，按1.2.1工艺制备烟叶碎片提取物，并测定酶法处理前后烟叶碎片提取物的蛋白质、氨基酸和还原糖的含量。1.2.4气质分析样品前处理取25ml三角瓶，准确称取3g烟草浸膏样品，向三角瓶内加入10mL纯净水和10卩l的乙酸苯乙酯作为内标物，摇匀，再加入5ml二氯甲烷，120r/min摇床机械震荡15min，静置分层，取出二氯甲烷相，浓缩至1ml，进行气质
12、分析。设所有检测出的物质相对于内标的校正因子9为1，采用相对定量的方法计算各致香成分的含量。GC/MS条件色谱柱：HP-5MS(50mX0.25mmX0.25卩m)毛细管柱；进样温度：250C；不分流进样；载气：He,1ml/min;升温程序：从50C(1min)以5C/min升到250C(5min);传输线温度：250C；离子源：EI源；电子能量：70eV;扫描范围：50-650amu;使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。2结果与分析2.1酶处理条件的优化2.1.1pH调节剂的优化分别选用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水将烟叶碎片提取液的pH值调节至7.0,探讨pH调节剂对烟草浸膏的评吸影响
13、，评吸结果如图2。37数分吸评35333129氢氧化钠氢氧化钾氨水pH调节剂图2不同碱性物质调节烟叶碎片提取液pH对烟草浸膏评吸结果的影响Figure2TheeffectofdifferentpHregulatoronsense-smokingoftobaccoextract从图2中看出，用氢氧化钠调节pH值制备的烟草浸膏评吸得分最高，与其他碱性物质调节pH相比，其感官评吸优点为：具有回甜感，刺激性较低，改善余味。因此，本实验选用氢氧化钠作为pH调节剂。2.1.2酶添加量的优化分别添加3.0g/L、6.0g/L、9.0g/L、12.0g/L中性蛋白酶，探讨酶添加量对烟草浸膏评吸影响，评吸结果图
14、3：3635数分吸评34333203691215酶添加量（g/L）图3酶添加量对烟草浸膏评吸的影响Figure3Theeffectofenzymeconcentrationonsense-smokingoftobaccoextract从图3看出，添加6.0g/L酶处理所得烟草浸膏的评吸得分最高，与其他添加量的酶处理相比，其感官评吸优点为：改善余味，因此，酶的添加量确定为6.0g/L。2.1.3酶处理温度的优化分别选用酶处理烟叶碎片提取液的处理温度35C、40C、45C、50C、55C，探讨酶处理温度对烟草浸膏评吸影响，评吸结果如图4:36数分吸评35343330354045505560酶处理温
15、度C)图4酶处理温度对烟草浸膏评吸的影响Figure3Theeffectofenzymetreatmenttemperatureonsense-smokingoftobaccoextract从图4中看出，当处理温度为40C时，所得烟草浸膏的评吸得分最高，与其他处理相比，其感官评吸优点为：香气量较高，具有回甜感，改善余味。因此，选用酶的作用温度为40C。2.1.4酶处理时间的优化选择酶的水浴时间为0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、16.0h，探讨酶处理时间对烟草浸膏37数分吸评365334评吸结果的影响，评吸结果如图5:3305101520酶处理时间（h）图5酶处理时间对烟草浸膏评吸的影响Figure3Theeffectofenzymetreatmenttimeonsense-smokingoftobaccoextract从图5中看出，酶水浴时间4h后所得浸膏的评吸得分最高，与其他处理相比，其感官评吸优点为：香气量和烟气劲头较高，干燥程度减轻。因此，选用酶的处理时间为4.0h。2.5酶处理对烟叶碎片提取物还原糖、氨基酸和蛋白质浓度的影响酶法烟草浸膏制备过程中还原糖、氨基酸和蛋白质的含量，如表2:表2酶处理对烟叶碎片提取物还原糖、氨基酸和蛋白质浓度的影响Table2Theeffectofenzymetreatmentont
