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1、青岛农业大学毕 业 论 文 题 目：惰性载体对瘤胃真菌产酶活性的影响 姓 名： 学 院： 动物科技学院 专 业： 动物科学 班 级： 1001 学 号： 20103867 指导教师： 王利华 2014 年 6 月 5 日惰性载体对瘤胃真菌产酶活性的影响动物科学专业 吴硕文指导教师 王利华摘要：本试验采用二因素试验设计，通过体外固态发酵试验，利用从崂山奶山羊瘤胃内分离纯化的一株真菌菌株探讨不同惰性载体（珍珠岩、沸石、膨润土）及不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%）对瘤胃真菌产羧甲基纤维素酶、-葡萄糖苷酶、微晶纤维素酶、滤纸酶酶活的影响。结果表明，沸石、膨润土添加组显著提高羧甲基纤维素酶活（P
2、0.05）。载体类型、添加量及载体类型与添加量互作对对微晶纤维素酶、-葡萄糖苷酶和滤纸酶均有显著影响（P0.05），以沸石为载体、添加量为0.2%时产酶活性最高。在发酵第8天时，各组酶活较高。综上所述，本试验条件下载体为沸石、添加量为0.2%、培养8天对瘤胃真菌产纤维素酶活最高。关键词：载体；添加量；载体类型；纤维素酶活Influence of inert Carrier on Cellulase Activities fermented by Ruminal FungusStudent Majoring in Animal Science Wu ShuowenTutor Wang Lihua
3、Abstract: Solid-state fermentation in vitro was adopted to study the effects of inert carrier types and supplements on cellulose activities by two factors experimental design. Carrier types included perlite, zeolite, bentonite, and carrier supplements were 0.2%, 0.4% and 0.6%, respectively. A fungus
4、 strain purified and isolated from the rumen of Laoshan dairy goats was fermented to produce cellulases. Carboxymethyl cellulase, -glucosidase, microcrystalline cellulase and filter paper enzyme were monitored. Compared to bentonite, zeolite and bentonite significantly improved Carboxymethyl cellula
5、se (P0.05). Carrier types, carrier supplements and the interaction of carrier types with supplements had significant effects on -glucosidase, microcrystalline cellulase and filter paper enzyme (P0.05). The zeolite supplement of 0.2% had the greatest activity of -glucosidase, microcrystalline cellula
6、se and filter paper enzyme. The cellulase activities had the greatest at fermentation time point of 8 day. It could be concluded from results that the zeolite of 0.2% had the greatest cellulase activities at 8 d fermentation in the present experiment.Keywords: carrier; supplement; carrier type; cell
7、ulase activity引言近年来，随着我国畜牧业的持续快速发展，畜牧生产对粮食的需求越来越大，这就给我国的粮食生产需要造成了很大的压力，致使人畜粮食矛盾越来越突出。纤维素类物质是地球上存在的最廉价、最丰富、最易得的一类碳水化合物。据估计，全球植物每年通过绿色光合作用生产的纤维素大约为4.01010 吨1。它们是自然界中存在量最大的一类可再生资源，然而大部分纤维素性的资源由于难以消化被白白浪费掉，甚至成为数量最大的一类环境污染物。我国是农业生产大国，每年都会产生大量的农业秸秆，而这可以很好的作为反刍动物的饲料。这些秸秆中的纤维素对于反刍动物来说，利用率很低，如何有效地利用纤维素类物质发展粮
8、食节约型畜牧业已经成为广大畜牧工作者共同的目标。2010年全国食用菌产量突破2200万吨，达2201.6万吨2。据国家统计局数据显示，每生产1 kg的食用菌，大约可产生5 kg的菌糠废弃物3。菌糠是指经栽培食用真菌菌后的废弃物，主要含有大量可利用率低的粗纤维、木质素和具有较高利用价值的菌丝体，还含有丰富的蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和微量元素4。虽在食用菌的初次发酵后可作为饲料来饲喂动物，并且通过动物饲养试验肯定了其饲料级价值，但是其营养物质含量仍较低，粗纤维含量相对较高，动物利用量较少，目前绝大部分菌糠被作为农业生产废料丢弃，白白浪费。瘤胃真菌是一类具有产较高纤维素降解酶活性的厌氧性微
9、生物，因其能够分泌羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶等多种酶类，越来越受到科研工作者的重视。如何提高瘤胃真菌的体外适应性和产酶活性是一项亟待解决的问题。另外，瘤胃真菌所产纤维素降解酶的体外作用条件及饲料降解的实际作用效果也有待验证。据了解虽然许多高校试验室都在做瘤胃真菌体外液态发酵产酶试验，但是测得的酶活性普遍较低，根本不能满足生产需要。本试验参考国内外采用生物膜技术来治理水污染的成熟的方法来进行瘤胃真菌体外固态发酵试验，以求找到能够提高酶活力的有效发酵方法。生物膜技术在国内饲料营养学上还较少运用，主要是以惰性载体（如沸石、珍珠岩、膨润土等）作为菌体生
10、长的依附面，使菌体迅速繁殖，快速形成一层生物膜，提高其对外界环境的适应性。该试验采用二因素试验设计，探讨不同惰性载体（珍珠岩、沸石、膨润土）、不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%）及发酵时间对瘤胃真菌产羧甲基纤维素酶、-葡萄糖苷酶、微晶纤维素酶、滤纸酶酶活的影响。1 材料与方法1.1 试验材料从瘤胃厌氧菌分离纯化的一株真菌菌株，由青岛农业大学动物科技学院动物营养与饲料科学试验室提供；玉米粉、麸皮、菌糠、花生蔓、珍珠岩、沸石、膨润土均为市售。玉米粉、麸皮、菌糠、花生蔓采用德国Henneherg和Stohmann7饲料概略养分分析方案对原料的概略养分进行分析。分析结果见表1。表1 原料常规养分
11、表Table 1 Nutrients compositions of materials in substrate原料 Crud material粗蛋白（%）CP粗脂肪 （%）CE中性洗涤纤维（%）NDF酸性洗涤纤维（%）ADF干物质（%）DM玉米7.813.1540.273.9687.93麸皮16.83.1846.137.9289.03菌糠9.330.3064.2436.4586.90花生蔓12.712.2155.4349.3091.31固体底物10.802.4049.1020.3088.60注：固态底物为玉米:麸皮:菌糠:花生蔓=4:2:2:2混合后的底物。1.2 试验仪器电子分析天平（上
12、海精科天美贸易有限公司，型号FA1204B）、电热恒温培养箱（龙口先科仪器公司）、高速离心机（EPPENDORF 5415D）、电热恒温水浴锅（浙江市三和仪器仪表公司，型号SY21-Ni）、电热鼓风干燥箱（吴江宏成电热设备有限公司，型号202B）、PHS-3C型pH计、二氧化碳罐、马弗炉（东莞市豪邦仪器设备有限公司，型号SX2）、立式压力蒸汽灭菌器（上海波迅实业有限公司医疗设备厂）、电子调温万用电炉（1KW4，龙口市先科仪器有限公司）、专用单向发酵袋。1.3 培养基的制备1.3.1 种子培养基制备本试验种子培养基的制备参照朱崇淼5的方法，见表2。1.3.2 平板培养基的制备：每升种子培养基中加
13、入琼脂15 g，配制而成。置于立式压力蒸汽灭菌器中经121高温高压灭菌后倒板冷却备用。1.3.3 固体发酵底物制备：按照玉米：麸皮：菌糠：花生蔓=4:2:2:2的比例配合发酵底物120 Kg，均匀混合后装袋备用。表2 液体培养基配方（每升含量）Table 1.1 Composition of culture medium (Every litres of content)成分Composition碳酸氢钠NaHCO3葡萄糖Glucose酵母膏Yeast cream蛋白胨Pepton缓冲液ABuffer A缓冲液BButter B 无细胞瘤胃液Cell-free rumen- fluid蒸馏水D
14、istilled water含量5.0 g1.0 g1.0 g1.0 g165 mL165 mL170 mL500 mL注：表中所用蒸馏水需要煮沸冷却后再使用，以便排除水中溶解的氧气。培养基在配置完成后，要加入1 mL 0.1%的刀天青水溶液作为厌氧指示剂。每升缓冲液A中，需含有硫酸铵3.9 g、氯化钠6.0 g、二水氯化钙0.4 g、磷酸二氢钾3 g和七水硫酸镁0.6 g，倒入已煮沸排除氧的蒸馏水溶解备用。每升缓冲液B中，需含三水磷酸氢二钾4 g，倒入已煮沸排除氧的蒸馏水溶解备用。制备无细胞瘤胃液的方法：在每天下午4点采取安装永久瘤胃瘘管的崂山奶山羊B的新鲜瘤胃液，静置沉淀半小时后，置于4000 r/min离心机中离心25 min，取上清液于烧杯中保存在-20冰箱中以备用。上诉培养基配制好后需通入二氧化碳23 h至饱和，再加入0.15%的L-半胱氨酸盐酸盐，以便使溶液尽可能的保持厌氧环境。以上步骤都完成后，采用高温高压经121灭菌15 min，常温冷却后备用。1.4 试剂配制1.
