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1、实验六：质粒DNA的提取与酶切姓名：胡艳敏 学号：201428010515041 组：第六组一、实验目的： （1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； （2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；二、 实验原理： （1）、质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有
2、复制与编码的有关酶。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤： 培养细菌，使质粒DNA大量扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA。 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。（2） 、碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DN
3、A的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。 （3）、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳： 关于电泳技术： 电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子尤其
4、是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。 琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5到4之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。琼脂糖凝胶电泳条带的观察： 通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000
5、bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview 溶液中进行染色 。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分
6、子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。 未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在： 超螺旋DNA： 尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。 线性DNA： 当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA
7、之间。 开环DNA： 在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。三、 实验仪器及试剂： （1）实验仪器：恒温培养箱、恒温摇床、高速离心机、漩涡振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、微量加样器、烧杯、量筒、玻璃棒、微波炉、天平、电泳梳子、电泳槽、电泳器、紫外灯等。（2） 实验试剂： 溶液I（Solution ）： 50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（
8、Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0 溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4。 溶液（Solution ）：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 溶液III （Solution ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL 5mol/L KAc， 11.5mL 冰醋酸， 28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L） TE液
9、缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0） 70% 乙醇； 平衡酚：氯仿 1：1： 将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。 LB培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 15g pH 7.0 琼脂糖（Agarose）； 1 liter（升）5TBE备用溶液（stock solution）： 54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0； 6凝
10、胶加样缓冲液： 0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue），40% 蔗糖（sucrose in water）； 另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview试剂。四：实验步骤 （一）细菌培养及质粒DNA的提取 1.培养细菌： 将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100g/ml氨苄青霉素的1LB中，37培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150l溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200l新配制的溶液II，加盖后温和颠倒510次，使之混匀，冰上放置2min。 4
11、.加入150l冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒510次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50l含RNase
12、 A 20g/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20备用。 （二）、质粒DNA的酶切 向0.5毫升Ep管中一次加入： 10BSA 2ml, 10reaction buffer 2ul,质粒DNA 6ul,水9ul轻混，稍事离心，然后加入两种酶液各0.5ul，轻混，稍事离心，置于37水浴1-4小时。 取10-15ul反应液和提取的质粒原样品电泳观察酶切结果。 （三）、DNA琼脂糖凝胶电泳 （1）1g琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。冷却到60，加入100ul的0.5mg/ml EB，并摇匀。 （2）洗好晾
13、干的制胶模板插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入制胶模板内，厚约4mm，室温冷却凝固。 （3）充分凝固后将制胶模板连同凝胶一起置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 （4）点样：用移液器吸取总DNA或质粒样品4ml于封口膜上，再加入2ul的6载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （5）电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，（长度以两个电极之间的距离计算），可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min，指示剂二甲苯青和溴酚蓝在电泳胶的中下段时停止电泳。 （6）看胶：用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察结果并记录，根据DNA Marker的位置来估测质粒的大小。五、 实验结果与分析 图中最后四个孔是我组样品跑胶的结果，观察图可知，质粒孔只有一条带，为闭环双链双螺旋，没有开环结构，质粒提取的比较完整，而前一组有两条带，说明在提取质粒的过程中有开环结构的产生。而我组酶切片段只有一条，这是由于跑胶时间过长，酶切下来的片段的位置不明显，而且很有可能与染色剂的位置相同，底色较深，条带不明显，不易观察。而质粒的条带颜色较浅，可能是提取的质粒DNA量较少（浓度过低）或电泳前加样量过少所致。
