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1、第三十六章 肾小管间质纤维化的发病机制及治疗进展肾脏纤维化是各种不同病因的慢性肾脏疾病进展到终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的共同病理过程，包括肾小球硬化与肾间质纤维化。近年来大量研究表明，肾功能的损害程度与小管间质病变的严重程度密切相关。肾小管间质损害程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标。因此，研究肾间质纤维化的分子机制，探索有效的防治措施，对延缓ESRD的进程，延长患者寿命意义重大。一、肾小管-间质纤维化的发病机制肾小管-间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展到后期的病理学特征，它以肾间质中细胞及胶原成分聚集增多、伴肾小管萎缩和扩张变形、
2、小管周围毛细血管减少、荒废、肾单位进行性破坏、致肾小球滤过率持续下降为特点。Eddy将肾小管间质纤维化过程大致分为四期，第一期是细胞活化和损伤期，表现为肾小管上皮细胞被活化，单核细胞迁移到肾间质，并成熟为巨噬细胞，肌成纤维细胞（myofibroblast, MFB）开始在间质聚集，这些细胞释放促进炎症发生的可溶性物质。第二期是致纤维化信号转导期，致纤维化作用的细胞因子和血管活性物质释放，如TGF-、CTGF、AngII、PDGF等，同时也释放抗纤维化作用的IFN-和HGF。第三期是纤维形成期，表现为基质蛋白合成增加和（或）降解减少，间质内原有的和新形成的基质蛋白开始沉积。第四期是肾脏结构毁损期
3、，表现间质基质蛋白过度沉积，小管及管周毛细血管网毁损，完整的肾单位减少，肾小球滤过率下降，最终导致肾脏硬化。经典的观点认为肾小管-间质纤维化的主要过程为：各种致病因素引起肾脏损伤后，肾小管上皮细胞释放致炎因子，如趋化因子（MCP-1、RANTES、IL-8、IL-10）和化学趋化物，诱导巨噬细胞浸润到肾间质。巨噬细胞和活化的肾小管上皮细胞释放大量的细胞因子，这些细胞因子及血管活性物质激活肾间质固有细胞，一方面促使间质成纤维细胞和小管上皮细胞转变为肌成纤维细胞，合成大量的胞外基质（extracellular matrix, ECM），另一方面由于基质蛋白降解酶活性降低，蛋白酶抑制物活性增强，因此
4、ECM大量堆积，促使小管间质纤维化的发生。（一）肾间质成纤维细胞和肌成纤维细胞正常情况下间质成纤维细胞处于静息状态，是一类低代谢、非激活状态的细胞，其表面标志有波形蛋白（Vimetin）、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast specific protein 1, FSP-1）。它能合成许多胞外基质成分如纤维连接蛋白（fibronectin, Fn）、胶原、胶原和胶原，同时它们也是ECM降解酶的一个主要来源，从而调节胞外基质代谢，对维持ECM内环境稳定具有重要作用。各种刺激损伤因素如炎症细胞浸润、细胞因子、细胞-细胞直接接触、缺氧及高血糖等都能诱导成纤维细胞活化增殖，发生表型改变，获得
5、表达平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)的肌成纤维细胞。无论原发疾病如何，在肾间质纤维化发生发展过程中，-SMA阳性的肌成纤维细胞（MFB）是导致病理条件下肾间质中ECM过度沉积的主要效应细胞。它的来源尚未完全清楚，有以下几种可能间质固有成纤维细胞：研究发现在一些致病因子的作用下,通过细胞因子的释放、细胞间相互作用、细胞外基质影响及环境因素的刺激,成纤维细胞可转为肌成纤维细胞；骨髓源性干细胞；循环纤维细胞；小管上皮细胞间充质转变（epithelial mesenchymal transition, EMT)，其中EMT是肾脏纤维化中MFB的主要来源。在纤维化疾病
6、愈合过程中，这些活化的成纤维细胞是怎样被清除的尚未阐明，可能有细胞凋亡(cell apoptosis)；恢复到静息的表型（quiescent phenotype）。因此深入理解肌成纤维细胞的生理清除，对于我们开发抑制小管间质纤维化进展的治疗策略具有重要意义。（二）肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT）1. EMT的定义EMT指成熟的上皮细胞失去其上皮表型，而获得未成熟的间充质表型的过程。发育生物学的研究早已阐明，在胚胎三胚层结构的形成中，上皮母细胞正是通过EMT的方式形成中胚层的原始间充质细胞。随后，中胚层的间充质细胞通过“间充质细胞向上皮细胞转变”的方式产生次级上皮细胞，而次级上皮细胞再
7、次通过EMT的方式形成中胚层和内胚层其他结构的细胞。成体分化发育成熟的上皮细胞在炎症、创伤等因素的作用下，又通过EMT产生间质纤维母细胞，参与组织纤维化的形成。而上皮组织来源的肿瘤细胞也是通过EMT实现肿瘤细胞在体内的转移。因此EMT是一种生物体进化过程中形成的“节省”机制，即细胞重新利用胚胎期已经存在的生物学过程来获得新的功能。2EMT的调节因素越来越多的证据证实上皮间充质转变是肾间质纤维化发生的关键事件。关于肾小管上皮细胞转分化的机制目前尚不十分清楚。其可能机制如下：某些间充质细胞决定基因的激活。在病理条件下，某些间充质细胞决定基因如FSP-1基因、v-src、v-ras、v-mos、c-
8、fos等基因被激活，上皮细胞决定基因如E-cadherin基因关闭。最近Venkov等发现在发生EMT的上皮细胞中，CBF-A/KAP-1蛋白识别并结合基因组的FTS-1位点，调节许多EMT相关基因的表达，从而推测FTS-1位点可能存在它们的启动子区， CBF-A/KAP-1/ FTS-1复合物是EMT的一个关键调节因素。某些细胞因子及代谢产物参与了上皮细胞转分化的发生，如TGF-、CTGF、bFGF、EGF、MMP-2、AGEs、IL-1等。目前对于细胞因子参与转分化的研究颇多，其中TGF-是最重要的诱导上皮细胞转变的细胞因子，许多其它细胞因子也都是通过TGF-来发挥作用的。Yang等在UU
9、O大鼠模型中发现，TGF-1诱导了EMT的发生,且参与转分化的全过程,是转分化的关键因素。Li等的研究证实，TGF-是上皮细胞-肌成纤维细胞转分化中的一个关键的细胞因子,通过Smad途径调节EMT，HGF可以阻断这一过程。近年来，很多研究证实CTGF也参与调节上皮细胞转分化。另外，近期研究证实，ILK是处于TGF-1/Smad下游的, 对EMT及肾间质纤维化至关重要的效应物。基质胶原成分影响上皮细胞转分化的发生，Zeisberg等观察到胶原的成分和装配调节转分化的发生，他们发现型胶原能维持近端小管上皮细胞的上皮细胞表型，而型胶原能促进上皮细胞向间充质细胞转分化。同时体内也存在许多内源性负性调节
10、EMT的因素，如HGF、BMP-7、Versican等，对维持机体内环稳定具有十分重要的意义。3. EMT与肾脏纤维化慢性肾脏疾病后期的病理特征是以进行性实质细胞减少和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积为特点的肾脏组织纤维化，进而导致肾功能进行性下降。其中肾间质损伤的程度是肾功能恶化的主要决定因素。无论原发疾病如何，在肾间质纤维化发生发展过程中，平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin, -SMA）阳性的肌成纤维细胞(MFB)是导致病理条件下肾间质中ECM过度沉积的主要细胞。其中EMT是肾脏纤维化中MFB的主要来源。10年前，Strutz等在抗
11、小管基底膜疾病的小鼠模型中发现小管上皮细胞表达成纤维细胞特异蛋白1（FSP1），因此推测EMT可能是肾脏纤维化形成中一个重要步骤。后来，Lan等在5/6肾大部分切除大鼠模型的分析为EMT的存在提供了形态学和表型转化的证据，切除后三周，当肾脏纤维化尚不明显时，肾小管上皮细胞即表达-SMA和肌动蛋白，而且随着疾病进展小管上皮细胞失去极性，细胞延长、变形，并且通过受损的小管基底膜进入小管周围间质。Yang等发现，在单侧输尿管梗阻模型（unilateral ureteral obstruction, UUO）中，有大量细胞共同表达-SMA和小管标志蛋白，提示的确在纤维化形成过程中有小管和间充质转变的存
12、在。目前许多实验模型如抗GBM肾炎、糖尿病肾病、肾毒血清性肾炎中均发现存在EMT。不仅如此，在人类慢性肾病中，Rastaldi等报道在136例患有不同肾脏疾病的穿刺标本中，不管其病理诊断如何均发现EMT不同程度的存在，而且发生EMT的肾小管上皮细胞数量与血清肌酐水平及间质损伤程度密切相关。Iwano等最近更有力的提示，在梗阻性损伤模型中，用特异性绿色荧光蛋白（GFP）标记成纤维细胞, 近端肾小管上皮细胞进行LAC-Z标记，发现在肾纤维化过程中肾间质14%15%成纤维细胞来源于骨髓，36%来源于肾小管局部EMT,其余来源于成纤维细胞的增殖，因其它节段小管也可能通过EMT产生成纤维细胞，因此研究仍
13、低估了EMT发生的比率，也进一步说明肾小管上皮细胞EMT积极参与了肾间质纤维化的形成。5. EMT及MET的细胞分子机制EMT发生在各种动物模型肾纤维化过程的晚期，提示小管上皮细胞在正常情况下并不发生表型转化，除非存在持久的慢性损伤。Yang等研究认为EMT是一种有序的调节过程，包括四个关键步骤：上皮细胞失去粘附能力；-SMA的表达及肌动蛋白的重组；肾小管基底膜破坏；细胞迁移和侵袭能力增强。研究已经发现体内许多因素可以调节EMT形成，如生长因子、细胞因子、蛋白酶、胞外基质成分、糖基化终末产物（GAEs）、缺血缺氧等因素。细胞因子在肾间质纤维化形成中发挥重要作用，其作用可分为促进纤维化和抑制纤维
14、化两种。正常生理情况下，抑制纤维化因素制约着促纤维化因素，从而维持肾脏的正常形态结构及功能；而当抑制作用被减弱时，这一平衡发生紊乱，则会导致纤维化形成。TGF-1是公认的EMT诱导剂，它可以单独引起并完成整个EMT过程，从而导致纤维化。进一步研究发现整合素连接激酶（integrin linked kinase, ILK）是TGF-1致EMT所必须的。最近Liu等研究发现CTGF呈浓度时间依赖方式增强小管上皮细胞ILK表达及促进EMT的发生，可能是其模块发挥作用。进一步通过小干挠RNA沉默ILK表达，减弱了CTGF诱导的EMT作用。整合素连接激酶是一种丝/苏氨酸激酶，能与细胞内的1整合素结构域以
15、及多种细胞内骨架蛋白相互作用，过度表达ILK能诱导EMT的4个关键步骤的发生。总之，TGF-1和表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）联合使用是EMT最有力的诱导剂。另外Wnt蛋白、IL-1、IGF-I/II等对EMT也发挥重要作用。研究发现在大多数组织损伤区域往往可以见到上述大量细胞因子联合发挥作用，因此难以区分何种细胞因子在启动EMT的过程中占据主导地位，每种细胞因子都可能发挥其独特的作用。在上皮细胞间充质转变过程中，TGF-1与其受体结合后活化的Smad蛋白为Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2和Smad3随后与Smad4一同进入细胞核，在核内调控
16、了TGF-1反应基因的转录。试验证实，定向阻滞TGF-1/ Smad3信号转导对单侧输尿管梗阻所致的肾小管间质纤维化具有保护作用。FGF-2与小管上皮细胞表面相应受体FGFR-1结合并激活后，一同进入细胞核内募集许多序列特异的转录因子，从而调节相应的靶基因转录。-catenin是细胞黏附连接的主要成分。正常情况下，胞浆中只有少量游离-catenin，大部分都与E-cadherin胞内结构域相连，胞浆内APC/GSK-3激酶/axin复合物可以降解-catenin，保持胞浆中游离-catenin在正常水平。LEF-1与Smad3或-catenin结合后可向细胞核内转移，是肾小管上皮细胞转分化中关键的分子机制。糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase-3, GSK-3）可使-catenin磷酸化，在细胞内与APC抑制复合物蛋白结合为复合物，并通过泛素化（ubiquitin action）过程使游
