2022年动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点

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1、动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点一、采样安排一采样地点 各相关省级兽医行政治理部门应在各自辖区范围内选定符 合数量要求的定点养殖场并报农业部兽医局备案，且须保证采样 的稳定性和连续性。各监测任务承当单位按照（监测方案）以及采样地省级兽医 行政治理部门提供的定点养殖场进行采样和别离细菌；负责对该 省设立的全国定点监测场长期跟踪监测大肠杆菌和肠球菌耐药 性变化趋势，每年采样 2 次，分上半年和下半年进行。二采样类型 采集泄殖腔或盲肠拭子作大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和弯 曲杆菌别离；采集新奇牛奶作金黄色葡萄球菌别离，依据养殖场 规模，每个场采样 50-100 份。三监测的细菌种类 包含大肠杆菌

2、、肠球菌分为屎肠球菌和粪肠球菌、沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌分为空肠弯曲杆菌和结肠弯 曲杆菌等。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可依据各地别离情况进行 监测。二、兽药使用调查 各监测任务承当单位要认真做好饲料和饲料药物添加剂来 源与种类调查、采样前动物使用抗菌药物情况调查预防用药和 医治用药和采集样品的统计，据实填写采样记录表。三、细菌别离与鉴定采纳选择性培养基，定向做大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌别离，用生化试验、PCR技术或血清 学方法对别离物进行鉴定。本年度别离监测的细菌种类与数量要 求见（监测方案）。别离到的菌株在-201以下加甘油爱护剂冷冻 保存或用其它适宜方

3、法自行保存，沙门氏菌和弯曲杆菌送中国兽 医药品监察所进行血清型鉴定后保存。四、药物敏感性测定 采纳经中国兽医药品监察所质量认定的药敏试验板进行药 物敏感性检测。目前，已实施质量认定的药敏板生产企业有：金 章科技开展和上海星百生物技术。检测用质控菌株由中国兽医药品监察所统一供给。五、结果报送 由中国兽医药品监察所将本年度总结任务分配到各监测任 务承当单位。各单位需在 11 月 25 日之前完成，并将电子版总结 报送中国兽医药品监察所。由中国兽医药品监察所汇总，在 12 月 31 日前报送农业部兽医局。采样记录表采样地：养殖场：采样时间：姓名、电话：样品来源猪日龄消化道呼吸道泌尿生殖道鸡日龄肝胆脑

4、淋巴结牛日龄关节奶样皮肤其他日龄粪便其他采样动物健康状况养殖量 健康 发病及病症：采样养殖场使用抗菌药情况饲料来源、添加抗菌药种类医治用抗菌药种类与使用方法生产厂名称饲料添加的药物名称剂量使用时间药物名称使用方法剂量单个动物剂量饮水添加剂量饲料添加剂量用药天数样品别离菌株大肠杆菌金黄色葡萄球菌肠球菌沙门氏菌空肠弯曲杆菌其他菌株编号：注：菌株编号按照“菌种、来源-采样地、采样年月-菌株编号 的格式进行。如EB-L0701-0001,其中：E大肠杆菌B牛 L鲁07年01月-0001菌株编号。菌种简写建议为：E大肠杆菌、S沙门氏菌、SA金黄色 葡萄球菌、ECi肠球菌、CJ空肠弯曲杆菌、CC结肠弯 曲

5、杆菌、动物简写建议为：B牛、P猪、C鸡注：a为喂奶猪或保温鸡，b为保育猪或生长鸡，c为育成猪或鸡，d为种母猪或产蛋鸡。动物源细菌别离和鉴定方法一、动物源大肠杆菌的别离与鉴定1 范围 本方法规定了用于动物源大肠杆菌别离与鉴定的方法。 本方法适用于各种动物中大肠杆菌的别离与鉴定。2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下2.1 冰箱：2-4C和-201。2.2 恒温培养箱：361C。2.3电子天平：感量0.1g。2.4 显微镜：10X100X。2.5 生物安全柜。2.6 生化鉴定卡或商品化试纸条。2.7 采样管或商品化采样棉拭子。2.8 微量加样器：1L1000 L。2

6、.9 吸头与微量加样器匹配。3 培养基和试剂3.1 运送培养基。3.2 麦康凯琼脂。3.3 大肠杆菌阳性血清。4 大肠杆菌别离与鉴定程序大肠杆菌别离与鉴定程序见图1。图 1：大肠杆菌别离与鉴定程序5.操作步骤5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。5.2 大肠杆菌的别离拭子接种于麦康凯琼脂平板，36C培养18-24h；挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，麦康凯琼脂纯化一代，纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，361C培养16-18h，待进一步细菌鉴 定。5.3 大肠杆菌的鉴定 对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化

7、拭条进行生化鉴 定。必要时，采纳大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定。二、动物源沙门氏菌的别离与鉴定1范围本方法规定了用于动物源沙门氏菌别离与鉴定的方法。 本方法适用于各种动物中沙门氏菌的别离与鉴定。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下2.1 冰箱：21-4*和-201。2.2 恒温培养箱：36C1C和42OC1C。2.3电子天平：感量0.1g。2.4 显微镜：10X100X。2.5 生物安全柜。2.6 恒温水浴锅：37C100C。2.7 PCR 仪。2.8 电泳仪。2.9 电泳凝胶成像分析系统或紫外透射仪。2. 10冷冻离心机。2.11 采样管或商品化采样拭子。2.

8、12小型离心管。2.13 微量加样器：1L1000 口L。2.14 吸头与微量加样器匹配。2.15 漩涡仪。2.16 微波炉。3培养基和试剂3.1 标准菌株：沙门氏菌CVCC 5413.2 DNA Maker3.3 Taq DNA聚合酶3.4 dNTP3.5 琼脂糖3.6 5XTBE缓冲液三羟甲基氨基甲烷Tris硼酸0.5M EDTApH8.0 加纯洁水至3.7 50XTAE buffer三羟甲基氨基甲烷TrisNA2EDTA.2H2O醋酸加纯洁水至3.8 invA基因引物上游为5 -GTG AAA TTA TCG CCA CGT下游为5 -TCA TCG CAC CGT CAA AGG3.9

9、 运送培养基。3. 11沙门氏菌显色琼脂。3. 12沙门氏菌阳性血清。3.13亚硒酸盐胱氨酸增菌液SC。3.14四硫磺酸盐增菌液TTB。3.15核酸染料。3.16氯化钠。4沙门氏菌别离与鉴定程序54.0g27.5g20mL1000mL242g37.2g57.1ml1000mLTCG GGC AA-3AAC C -3沙门氏菌别离与鉴定程序见图2。图 2 沙门氏菌的别离和鉴定程序5.操作步骤5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔肛门样品， 置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。5.2 沙门氏菌的别离将拭子置于SC增菌液，36C培养18-24h或TTB增菌液，42C培

10、养22-24h。将菌液混匀，接种沙门氏菌显色培养基，361C培养22-24h。挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落，接种营养琼脂平板，361C培养16-24h，待进一步细菌鉴定。5.3 沙门氏菌的鉴定生化鉴定对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴 定，或者通过的方法进行分子生物学PCR鉴定。必要时，用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。PCR法鉴定.1 PCR模板的制备用接种环从营养琼脂上挑选16-24h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水 中，12022r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100C 沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷

11、却后以12022r/min离心2min，取上清液为PCR 模板。.2 PCR反响体系的配制依据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反响体系，扩增片段长度约284 bp。.3 PCR反响条件95C预变性5min，94C变性30s, 64C退火30s，72C延伸30s, 30个循环， 最后72 C延伸10min，同时设立阴性和阳性对比。.4 电泳.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备称取1.2g琼脂糖，参加100mL0.5XTBE或1XTAE缓冲液中，参加核酸染 料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘 中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中

12、，加 0.5XTBE或1XTAE缓冲液淹没胶面。.4.2 加样取lOpLPCR扩增产物和3pL上样缓冲液混匀后参加加样孔，每次电泳时，各做 一个阳性对比和阴性对比。.4.3 电泳条件电压110V，电泳时间30min。.5 结果判定 电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上翻开紫外灯观察或用凝胶成像仪进 行成像分析。如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对比的条带在一条直线 上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对比无此条带，则该样品别离到的菌株 可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。三、动物源金黄色葡萄球菌的别离与鉴定1 范围本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的别离

13、和鉴定方法 本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的别离和鉴定2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：01-4*和-201。2.2 恒温培养箱：36C1C和42C。2.3 显微镜：10X100X。2.4商品化或zi制采样管。2.5 无菌离心管2.6 离心机。2.8 商品化拭条或微生物鉴定仪。3 培养基和试剂3.1 标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC292133.2 显色培养基3.3 7.5 %氯化钠肉汤10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤3.4营养肉汤或BHI肉汤3.5 营养琼脂3.6 新奇兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆3.7 0.3%过氧化氢

14、液3.8 0.85%无菌生理盐水4 金黄色葡萄球菌别离和鉴定程序金黄色葡萄球菌别离和鉴定程序见图3。ImL牛奶+9mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤，上呼吸扁桃体、动物组织道拭子直接放入肉汤中，混匀金黄色葡萄球菌显色培养基可疑菌落营养琼脂触酶试验阳性生化鉴定血浆凝固酶试验金黄色葡萄球图3 金黄色葡萄球菌别离和鉴定程序5 操作步骤5.1 采样牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，0-4C保存， 不超过48h。扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭 子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，0-4C保存不超过48h。吸取ImL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化 钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。5.2 增菌和别离培养将上述样品匀液于361 C培养18-24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉 汤中呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织 直接划线，361 C培养24-48h。挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一