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1、实验一 凝集试验颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等 ）与相应抗体结合后，在有适量电解质存在 下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应 （Agglutination reaction） 或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen ）,抗体称为凝集素 （ Agglutinin ）。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷， 在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状 态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原 分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于 离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去
2、了彼此间的静电排 斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据 是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类， 本实验主要介绍直接凝集反 应。目的要求1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。材料与试剂1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm ）,试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。2. 灭菌的生理盐水，灭菌的 0. 5%石炭酸生理盐水。3. 布氏杆菌病试
3、管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板 凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪） 。4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法 （一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1. 试管准备：每份血清用试管 4支，另取 3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做 1份。2. 被检血清稀释：第 1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第 2、3、4管加 入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清 0.2 ml ， 加入第1管中，反复吹
4、吸 5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中， 混匀后吸取 0.5 ml 加入第3管，依此类推至第 4管，混匀后吸弃 0.5 ml （见表 1-1） 该被检血清的稀释度分别是 1:12.5、1:25、1:50、1:100。3. 对照管制作：第 5管中加 0.5% 石炭酸生理盐水 0.5 ml ，第6管加1:25稀 释的布氏杆菌病阳性血清 0.5 ml ，第 7管加 1:25 稀释的布氏杆菌病阴性血清 0.5ml 。4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用 0.5% 石炭酸生理盐水作 1:20稀释， 每支试管加 0.5 ml 。表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单
5、位： ml ）试管号最终血清稀释度0.5%石炭酸生理盐水被检血清抗原（1： 20）:251： 501： 1001： 2002.30.5 0.5?0.5 i、 I卜、 J0.20.50.50.50.510.50.50.51阳性血清阴性血清1： 251： 250.50.50.50.50.50.5弃0.5弃1.55. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于 37C温箱中4-10h，取 出后置室温18-24h （或37C温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37C温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、
6、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。：100抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底， 振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。：75抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与 100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。：50抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显 的凝集）。：25抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底 中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。7. 判定标准：能使 50% 抗原凝集的血清
7、最高稀释度称为该血清的凝集价（或称 滴度）。牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于 1:100 ，判为阳性， 1:50 的凝集价判为疑 似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于 1:50 ，判为阳性，1:25 的凝集价判为疑似反应（可疑） 。注意事项1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结 果。2. 结果判为可疑时，隔 2-3 周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判 为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者， 马、猪重检仍为可疑， 判阴性； 牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。（二）布氏杆菌病平板凝集试验1. 加血清：
8、取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2）,并注明被检血清号码，以lOOyL微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内， 第l格80yL、第2格40yL、 第3格20yL、第4格10yL。血清用前需放室温，使其温度达 20C左右。每一份检样 需换一个 tip 头。大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40yL 和 20yL ；猪、山羊、绵羊、狗用 80yL 和 40yL。2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原 30 y L,滴在血清附近，而不与血清 接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。抗原用前摇匀，并置室温使其温度达 20 C左右。3. 作
9、用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30 C左右，3-5min内记录反应结果。4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。：出现大的凝集块，液体完全透明，即 100% 凝集。：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即 75% 凝集。：有可见凝集块，液体不甚透明，即 50% 凝集。：液体混浊，有小的颗粒状物，即 25% 凝集。：液体均匀混浊，无凝集现象。6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表 1-2。表 1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系平板凝集80yL40yL20yL10yL相当于试管凝集1:251
10、:501:1001:2007. 判定标准：同试管凝集试验。8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。（三）虎红平板凝集试验 这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验 可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比， 具有操作简单、 快速、特异性强的优点。1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各 30yL滴于玻璃板的方格内，每份 血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20C） 4-10min内记录反应结果。同 时以阳、阴性血清作对照。2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任 何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的
11、判为阴性，无可疑反应。3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温 30-60min 后再进行 试验。（四）鸡白痢平板凝集试验1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各 1滴（约30yL）滴于玻板或载玻片上， 用牙签或火柴棒充分混合。2. 结果判定：在室温（20C ）下，观察30-60S，凝集者为阳性，不凝集者为阴 性。思考题1. 凝集反应的原理是什么 ?2. 哪些因素影响细菌凝集试验 ?3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？实验二 病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种 （些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性 设计的试验称血球凝集（HA）试验，以此来
12、推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性 的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制 （HI） 试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病 毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。目的要求掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。材料与试剂1. 96孔“U”形或“ V”形微量反应板，50yL定量移液器，滴头，微型振荡器。2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液） ，新城疫阳性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法 （一）血球凝集（HA）试验1. 在96孔微量反应板上进行，自
13、左至右各孔加 50yL生理盐水。2. 于左侧第1孔加50yL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50yL 至第2孔，依次倍比稀释至第11孑L,吸弃50yL；第12孔为红细胞对照。3. 自右至左依次向各孔加入 0.5%鸡红细胞悬液50yL，在振荡器上振荡，室温 下静置后观察结果（表 4-1）。表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位： yL）101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 对照生理盐水50病毒液50505050505050505050X5050505050505050V505050*500.5%红细胞
14、505050505050505050505050结果观察 +4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为 100% 凝集（ + ），不 凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表 4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分 别为2、 4个血凝单位，或将 128/4=32，即1:32稀释的病毒液为 4个血凝单位。（二）血球凝集抑制（HI）试验1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第 1孔至第 11 孔各加50 yL生理盐水。3. 第1孔加被检鸡血清50吐，吹吸混合均匀，吸50pL至第2孑L,依此倍比稀 释至第10孑L,吸弃50yL，稀释度分别为：1:2、1:4、1:8；第12孔加新城 疫阳性血清50yL，作为血清对照。4. 自第1孔至12孔各加50yL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用 10min 。5. 自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50yL，振荡混合均匀，室温下静置 后观察结果（表 4-2）。祭6. 结果判
