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1、高效液相色谱法测定甜叶菊中甜菊糖总苷的含量关键词：利用高效液相色谱法对甜叶菊干叶中甜菊糖总苷含量开发出一种新的检 测方法，通过单因素试验，确立了检测方法，即样品经 30%乙腈超声提取、孔径为 0.45pm的有机滤膜过滤后，选择C8(250mmx4.6mm, 5pm)色谱柱；以78%的0.1% 磷酸水溶液+22%乙腈(体积比)为流动相，1.0mL/min的流速进行洗脱。在210nm 波长及40柱温下利用DAD检测器检测，用外标法定量。得出的图谱峰形尖锐，结 果回收率高、检测结果准确、精密度高、重复性良好。说明此方法开发具有较强的可 行性。关键词：高效液相色谱法；甜叶菊；甜菊糖总苷Determin
2、ation of stevioside in stevia rebaudiana by high performance liquid chromatographyAbsrtact: a new detection method for stevioside content in stevia rebaudiana dry leaves was developed by high performance liquid chromatography. through single factor test, the detection method was established, in othe
3、r words,C8(250mmx 4.6mm, 5pm) chromatographic column was selected after the sample was ultrasonically extracted with 30% acetonitrile and filtered by 0.45pm organic filter membrane. Elution was carried out at a flow rate of 1.0mL/min with 78% 0.1% phosphoric acid aqueous solution +22% acetonitrile (
4、volume ratio) as mobile phase. At 210nm wavelength and 40口 column temperature, DAD detector was used for detection and external standard method was used for quantification. The obtained chromatogram has sharp peak shape, high recovery rate, accurate test results, pinpoint accuracy and beautiful repe
5、atability. This shows that the development of this method is feasible.Key words: high performance liquid chromatography; Stevia rebaudiana; Stevioside total glycoside1 前言食物是人类得以生存的必备保障，食物的主要成分与构成人体的基本物质相同， 人类可从食物中获取人体生长的营养物质及能量。随着历史的发展，生活质量的提高， 人类得以发现不同的口味。食品味道有着明显的多样性，而人类对甜味有着天然的喜 爱。随着食品科学、食品工业的不断发
6、展，为了丰富食品的味道，满足人们味蕾对食 品不同口味的需求，食品相关研究人员对甜味剂的研究也在持续努力。现在市场上的 甜味剂种类繁多，比如天然和人工合成甜味剂因其来源不同而被划分；营养性甜味剂 和非营养性甜味剂因其营养价值不同而被归类；而糖类甜味剂和非糖类甜味剂因其化 学结构和性质的不同而被划分。食品工业中常用的甜味剂有糖精钠、麦芽糖醇、安赛 蜜、木糖醇、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊糖等。正是因为食品工业中用到的甜味剂繁多，消费者也就更加地重视这些甜味剂的安 全问题，安全无毒、健康绿色的天然甜味剂更受消费者的欢迎。而大多数人工合成的 甜味剂不会被小肠吸收，但到达大肠后会对肠道菌群产生较大的影响，从而
7、让血糖升 高，长此以往出现“胰岛素抵抗”的问题。而甜菊糖苷作为新兴的天然甜味剂，是 一种低热量、高甜度（甜度约是蔗糖300倍）的天然甜味剂2。同时，其具有降低血 压、控制血糖、抗腹泻、一定程度上提高免疫力、促进新陈代谢等效果。另外，甜菊 糖苷可消除蔗糖的副作用，所以对控制肥胖症和小儿龋齿有非常显著的功效，同时对 调节胃酸、恢复神经疲劳也有很好的功效，可降低心脏病的发病率3。甜菊糖苷又可 作为矫味剂，其甜味强烈，回味时间长，后味可口，有较长清凉爽口的感觉，同时可 以增强或改善其它的很多甜味剂。因此，甜菊糖苷普遍被加入某些药物，如片剂、丸 剂、胶囊以矫正异味、苦味等。甜菊糖苷不易被酸碱反应，酸碱度
8、在4到10之间， 用水加热，其化学结构还能保持原有性质，不会产生葡萄糖而容易被微生物作用，属 于非发酵性的物质。在国内外，甜菊糖苷在食品工业和药品方面应用广泛，目前及未 来市场均巨大。甜菊糖苷从甜叶菊中提取。甜叶菊（Stevia rebaudiana）又称之为甜菊、糖草、 甜草、甜泽兰等，属于菊科甜叶菊属的多年生草本植物，浅根系植物，甜叶菊有以下 习性：喜欢温和的生长环境、不耐高温，温度为25-30C最适合茎叶的生长；喜欢湿 度较高的土壤且怕旱，生长期更喜湿，但又怕渍。甜叶菊原产于南美洲巴拉圭、巴西 的原始森林，最早引进的是日本，我国于1977 年由南京中山植物园从日本引进甜叶 菊， 1978
9、 年试种成功4。目前云南、北京、陕西、新疆维吾尔自治区、江苏、广西、 安徽、福建、河北、湖南等地都有栽培种植。联合国粮农组织、世界卫生组织食品添 加剂联合专家委员会在 2008 年6 月第69 届会议报告中明确表明：正常人甜菊糖苷每 日摄入量在 4 毫克/千克体重以下时对人体没有副作用5。甜叶菊的甜味活性物质是甜菊糖总苷(包括甜菊糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、 瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M、甜茶苷、甜菊双糖苷、杜尔可 苷A等)，瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A)是甜菊糖总苷中的主要成分，其分子式为 C44H70O23，分子量为967.01, CAS号为58543-16
10、-1，结构式见图1。图 1 瑞鲍迪苷 A 的结构式瑞鲍迪苷A为白色结晶性粉末，能溶于水、甲醇、乙醇、乙腈等溶剂。目前甜菊糖苷检测方法众多，如液相色谱法、近红外光谱法、反相高效液相色谱 法、液质联用质谱法等。反相高效液相色谱法、液质联用质谱法适合鉴定分离甜叶菊 的各个成分6-8，但前处理比较复杂、时间成本大；近红外光谱法直接扫描甜叶菊干 片非常高效9，但操作难度较大，定标样品的选择、制备、精确的化学分析对于人员 的专业要求较高，该法适合于有一定研究能力的检测公司或研究所。高效液相色谱法(HPLC)因其操作简单，精确度高，效率高等优势，而被当做常用检测方法。例如， 刘超采用高效液相色谱法测定甜叶菊
11、糖中的甜叶菊糖和莱鲍迪苷 A 的含量10。李红 采用氨基柱，乙腈 水为流动相测定 14 个地区甜叶菊糖苷含量 11。中华人民共 和国出入境检验检疫行业标准：出口甜叶菊总糖甙含量的测定中方法一等都涉及 HPLC 12。 HPLC 的原理：单一或不同比例流动相经混合以后经高压系统输送13, 输 送过程中待测样品在利用各成分的分配系数和相互作用力的不同而在固液两相之间 引起排阻作用,使得各物质的运动速度不同,经过洗脱在检测器产生电信号作用，通过 记录仪记录出待测样品的图谱。本论文的目的是研究出一种检测未经加工的甜叶菊原料中甜菊糖总苷含量的检 测方法，确定各个试验参数，最终根据甜叶菊原料中各个甜度活性
12、成分的图谱计算总 苷含量，从而确定甜叶菊原料的好坏,分析不同品种、不同地域种植出的甜叶菊原料 中甜菊糖总苷各成分含量和总含量的差异，为培育优良品种提供数据支撑。甜菊糖总 苷高的说明可从中提取的糖苷含量更多，表明其原料好。2 材料与方法2.1 仪器、材料及试剂2.1.1 仪器 样品的前处理及上机检测时用到较多仪器设备，故常用的仪器不列出。仪器及设备见表 1。表1仪器及设备仪器设备名称型号/规格厂家分析天平X205BMU/感量 0.00001g梅特勒-托利多集团超声波清洗器SK7200H上海科导超声仪器有限公司温度计0C-100C常州坤鼎热工仪表有限公司连盖圆底离心管5ml海门市三和镇弘澄实验器材
13、厂高速台式离心机TG16-WS（高转速 16000r/min）长沙湘仪离心机仪器公司有机系/水系直径：13 mm,天津市津腾实验设备有限公司针头过滤器孔径：0.45pm高效液相色谱仪（配二安捷伦科技有限公司极管阵列检测器）Agilent 1260真空泵GM-0.5A天津市津腾实验设备有限公司超纯水机（一级用水）SUP-20-C山东汀兰环保科技有限公司C18柱250mmx4.6mm,5.0 pm广州菲罗门科学仪器有限公司C18柱250mmx4.6mm,5.0 pm浙江月旭材料科技有限公司5柱250mmx4.6mm,5.0 pm北京绿百草科技发展有限公司2.1.2 材料 样品：桂林市中药材批发市场
14、采购的甜叶菊干叶，经粉碎机粉碎成粉末状。瑞鲍迪苷A标准品：购于Chromadex，纯度93.0%,批号：00018226-P36。2.1.3 试剂超纯水由桶装纯净水经过超纯水机纯化后经孔径为0.45 pm的水相滤膜过滤可得。试剂见表 2。表2试剂试剂名称级别厂家甲醇分析纯西陇科学股份有限公司磷酸分析纯西陇科学股份有限公司超纯水一级（自制）密理博（中国）有限公司乙腈色谱级美国天地2.2 试验方法2.2.1 试剂配制0.1%磷酸水溶液：用ImL移液管精密量取l.OOmL磷酸于1L流动相瓶子中再加 入1000mL超纯水，置于超声波清洗器中超声混匀，用0.45pm水相滤膜过滤得。30%甲醇：用量筒分别
15、量取300mL甲醇和700mL超纯水，于2L锥形瓶中混匀 即得。30%乙腈：用量筒分别量取 300mL 乙腈和 700mL 超纯水，于 2L 锥形瓶中混匀 即得。2.2.2 标准溶液的配制精密称取瑞鲍迪苷A标准物质25mg （精确至0.01mg）于25ml容量瓶中，加入 适量的 30%乙腈于超声波清洗器中超声溶解，充分溶解后取出冷却至室温后用 30% 乙腈定容至刻度，摇匀，即得浓度约为1.0 mg/mL的标准溶液，置于冰箱保存备用， 保存温度为4C。标准曲线溶液的配制：分别精密吸取标准溶液 （1.0 mg/mL）8.00mL、4.00mL、 2.00mL、1.00mL于10mL量瓶中，用30%乙腈定容至刻度，得到浓度分别为0.8mg/mL、 0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的系列标准溶液，再将0.1mg/mL的溶液逐级稀释 成浓度为 0.02mg/mL、 0.01mg/mL、 0.002mg/mL、 0.001mg/mL 的溶液，供高效液相 色谱仪测定14。2.2.3 样品的处理称取约0.5g （精确至0.00001g）粉碎均匀的甜叶菊干叶置于50mL容量瓶中，加 入适量的提取溶剂于超声波清洗器中超声提取后，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 转移至5ml离心管于高速离心机以10000r/min的转速离心，
