碳青霉烯酶进展

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1、碳青霉烯酶的研究进展碳青霉烯类具有非常广泛的抗菌活性，因能抵抗大多数内酰胺酶 的水解，故常用于产超广谱-内酰胺酶（ESBL）和/或去阻遏AmpC - 内酰胺酶（AmpC）菌株引起严重感染的治疗但碳青霉烯耐药肠杆菌 的出现，给临床治疗带来了极大困难。通常，革兰阴性菌对碳青霉烯 类的耐药机制，一是AmpC酶过度表达联合OMP丢失;二是PBP对 碳青霉烯类亲和力的改变；三是碳青霉烯酶（Carbapenemases）的 产生在这些机制中，最突出的是碳青霉烯酶。一、碳青霉烯酶的分类及有关细菌碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类B -2内酰胺酶，包括Ambler分子分类的A、B、D 3类酶。

2、A类为丝氨酸酶，其活性部位具有丝氨酸结构，属于Bush分群中 的第2f亚组。A类碳青霉烯酶少见，包括阴沟肠杆菌（I M 12 1 和NMC2 A）、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC2 A、Sme2 1、Sme2 2、Sme2 3、I M 12 1酶，以及肺炎克雷伯菌、铜绿假单 胞菌中质粒介导的KPC1、GES2 2酶。这类酶都是青霉素酶他们 对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可以引起青霉素类、氨曲 南、碳青霉烯类耐药,而对第3代头抱菌素通常敏感。三唑巴坦、克 拉维酸可以抑制此类酶,但不被乙二胺四乙酸（EDT A）所抑制。Amble分类D类为丝氨酸酶，属于Bush分群中的第2d亚组，其 活性部位

3、具有丝氨酸结构，由blaOXA等位基因编码，仅见于不动杆 菌。Amble分类B类是金属酶，属于Bush分类3组,是一种需金属离子发挥活性的B-内酰胺酶，由bla I MP、blaV I M、blaSPM和blaGI M编码，可被EDT A所抑制，染色体介导或质粒介导,存在于 多种不同革兰阳性和革兰阴性细菌中。金属酶均可明显水解亚胺培南, 能水解除单环类抗菌药物以外的绝大多数B -内酰胺类抗菌药物，但对 于其他B -内酰胺类抗菌药物的水解能力有较大差异。临床使用亚胺 培南等碳青霉烯类抗菌药物大大增加，导致金属B -内酰胺酶产生率 有不断上升的趋势。目前尚未开发出有效的金属酶抑制剂。二、碳青霉烯酶

4、的研究进展对碳青霉烯酶的研究主要着重于对A、B、D 3类酶的种类、分 布、生化特性、流行病学等的研究和相关菌株耐药性的研究。（一）A、D类碳青霉烯酶的研究1、A类碳青霉烯酶的研究自从20年多前发现第一个A类碳青霉烯酶以来，至今已发现6群 不同的酶，包括 GES、KPC、SME、IMI/NMC-A、SHV-38 和 SFC-1, 其中GES、KPC和IMI-2由质粒编码，其他均由染色体介导依据 Bush-J-M分类系统，这些酶分为4个不同的表型 亚群，即2br、2be、2e和2f亚群。与其他A类-内酰胺酶一 样，a类碳青霉烯酶利用活性位点丝氨酸残基灭活-内酰胺类药物， 可水解青霉素类、头抱菌素类

5、、单酰胺类和碳青霉烯类，这种活性可 被克拉维酸和他唑巴坦所抑制，但对edta不敏感。成熟a类碳青霉烯酶是单体酶，含有265269个氨基酸残基，分 子量为2532kDa，pl为5.89.7。与其他丝氨酸酶一样，A 类碳青霉烯酶也通过3步催化机制(包括酰化和脱酰基)来发挥作用。 与D类和B类碳青霉烯酶一样，对美罗培南的水解率低于亚胺培南， 但对美罗培南的亲和力却始终高于亚胺培南。尽管A类碳青霉烯酶群体中的氨基酸序列一致性较低，但却具 有能使它们水解碳青霉烯类的相似的蛋白折叠(Proteinfolds)。除 SHV-38以外，A类碳青霉烯酶的一个共同特征，是在Cys69 和Cys238之间均含有一个

6、二硫键，这个键可以稳定蛋白折叠。二硫 键是水解所有-内酰胺类所必需的，并非仅针对碳青霉烯类的水解， 它是稳定酶结构的一种需要。目前，产A类碳青霉烯酶菌株感染仍较少见，大多为零星出现 SME、IMI/NMC-A和SFC-1均由染色体编码，尽管对碳青霉烯类表 现为高水平耐药，但对超广谱头抱菌素仍保持敏感，因此，目前尚未 引起广泛的临床问题。令人担忧的是KPC和GES酶的出现与扩散。 2、D类碳青霉烯酶的研究1993年，PAT ON等报道的第一个具有碳青霉烯酶活性的B -2内 酰胺酶，纯化于1985年分离于苏格兰爱丁堡病人的多重耐药鲍曼不 动杆菌，命名为AR 12 1。直到2000年QONALD等对

7、AR 12 1酶 的氨基酸进行序列分析，将其命名为0XA2 23。20002004年之间， 在世界各地又发现了 6种新的D类碳青霉烯酶。随后又在许多国家 碳青霉烯类耐药菌株中发现了 7种D类酶。迄今为止，在121种OXA 型酶种，至少有45种具有碳青霉烯酶活性。成熟D类碳青霉烯酶含有243260个氨基酸残基，分子量 为2335.5 kDa不等，p I为5.1 9.0。该类酶对亚胺培南的 水解速率是青霉素的1%3% ,对苯唑西林的水解速率是青霉素的2 倍,对三代头抱菌素的水解活性很弱;其活性可被他唑巴坦和克拉维 酸所抑制。对携带编码D类碳青霉烯酶重组质粒的大肠埃希菌转化结合子 或转化株的体外抗生

8、素敏感性研究发现,它们对氨基青霉素和羧基青 霉素高水平耐药，对脲酰基青霉素的敏感性不定（仅OXA2 40 和OXA2 48对哌拉西林耐药）；对头抱菌素类，包括窄谱头抱菌 素、氧亚氨基头抱菌素和72 a 2甲氧基头抱菌素、氧头抱烯类以及 单酰胺类均敏感（仅OXA2 48对头抱噻吩耐药）。除了 OXA2 23显 示哌拉西林在他唑巴坦存在下其M I C值降低8倍以外，其他对克拉 维酸和他唑巴坦的抑制作用不敏感。通常，D类碳青霉烯酶表现出弱碳青霉烯水解活性，产该类酶的分 离菌对碳青霉烯类的耐药，可能是同时伴有其他耐药机制的结果，如 外膜孔蛋白丢失、泵出作用增强、青霉素结合蛋白（PBP）改变等。 产D类

9、碳青霉烯酶（OXA2 51除外）均显示对亚胺培南和美罗培南的 高水平（M I C 8 mg/L ）耐药,但在大肠埃希菌中仅表现为敏感性 减低(M I C W2mg/L),有力证明了其他耐药机制的存在。PO I REL 等报道的产0XA2 48的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类高水平耐药(M I C = 64 mg/L )，可能是由于该菌株blaOXA2 48基因与IS1999联合 导致OXA2 48的过度产生、以及36 kDa孔蛋白缺乏所致。产OXA2 24的鲍曼不动杆菌中，由于2种外膜孔蛋白(22 kD和33 kD)表达减低限制了外膜通透性，从而导致了对亚胺培 南和美罗培南的高度耐药(其M I C分

10、别为128和256mg/L)。而产 生OXA2 23和OXA2 58的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的高水平(M I C$32 mg/L)耐药,可能是D类碳青霉烯酶的高度表达与泵出作用 增强的结果。此外，产D类碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌也可对非B2内酰胺类 抗生素耐药，如氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、氯霉素和四环 素等。D类碳青霉烯酶主要分布于临床分离的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，以OXA2 23最为流行，其次是OXA2 58和OXA24O。1998 年以来，产OXA2 23不动杆菌引起的医院暴发感染见于世界各地，如 巴西、英国、塔希提岛等。韩国某医院产OXA2 23鲍曼不动杆菌的 暴发感染持续了

11、8个月，涉及36例病人。在我国，李蓉等报道了南昌 鲍曼不动杆菌流行株80%携带OXA2 23基因。王辉等报道，在收集 的来自19992005年我国不同地区11家教学医院的221株亚胺培 南耐药不动杆菌中，97.7%的菌株含有OXA2 23样基因，说 明OXA2 23在我国广泛分布。DA SI LVA等则报道了 19982003年分离于3家葡萄牙大学医 院162株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌，所有菌株具有类似的多重耐药 模式，包括亚胺培南耐药(M I C 32 mg/L)。结果显示，多重耐药鲍 曼不动杆菌流行克隆携带blaOXA2 40表明OXA2 40在葡萄牙存在 持续流行。2005年,LO2LA

12、NS等报道了产OXA2 40鲍曼不动杆菌 在美国芝加哥多个城市引起的暴发感染，100株鲍曼不动杆菌中， 97%均归于1个克隆，说明在该地区为鲍曼不动杆菌的单克隆传播。实验已经证明，细菌产生针对某一底物的低水平活性酶，当这个 底物存在时可能促进这个酶更有效。从广谱酶进化到超广谱酶、耐 酶抑制剂酶或碳青霉烯酶的现象在产SHV酶的铜绿假单胞菌、鲍曼 不动杆菌中已经得到证实。因此，可以预言，碳青霉烯类抗生素的广泛 应用可能导致铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌产生更有效的水解酶， 其前景另人担忧。(二)相关菌株耐药性的研究1、鲍曼不动杆菌耐药性及碳青霉烯酶的研究鲍曼不动杆菌(A ci netobacter b

13、aumanni i , A .B aumanni i)是 重要的医院感染病原菌，在发生于下呼吸道医院感染的革兰阴性病原 菌中，其仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，居第三位。其耐药率逐 年上升，出现了泛耐和全耐菌株，世界各地均有多重耐药A . B aumanni i导致医院感染流行的报道。在综合性医院的ICU及移植病 房，常常因为多重耐药A . B aumanni i感染导致最终的治疗失败。鲍 曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药机制主要包括通透性降低、流出泵过度 表达、碳青霉烯酶的产生。其中OXA型碳青霉烯酶是引起世界范围 鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的最重要原因。目前实验研究显示鲍曼不动杆菌对亚胺培

14、南、美罗培南、头抱哌 酮/舒巴坦较为敏感，对其他抗菌药物耐药情况严重;对耐碳青霉烯类 药物的菌株多重耐药性尤其显著，临床应加强检测和监测。主要方法 为PCR检测及基因序列分析。魏艳艳对2005年安徽省部分医院(18家)临床分离的鲍曼不动杆菌 的耐药性进行了研究。结果显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最 低(6.4%)、其次为美罗培南(20.5%)和头抱哌酮/舒巴坦(29.7%)，对四 环素的耐药率最高(81.5%);其余抗菌药物耐药率均在50%左右或以 上。采用聚合酶链反应扩增IMP、VIM、OXA型碳青霉烯酶基因并 测序并采用ERIC-PCR方法进行产酶菌株的同源性检测显示安徽省 18家医院

15、分离出的耐亚胺培南和/或美罗培南鲍曼不动杆菌主要产 OXA- 24型和IMP型碳青酶烯酶，部分菌株同时产2种或以上碳青霉 烯酶，且少数产酶菌株间存在克隆传播现象。冯红军等对在平顶山市第一人民医院收集到的亚胺培南耐菌株 进行耐药性分析，并对碳青霉烯酶基因进行了检测。217株鲍曼不 动杆菌中头抱哌酮/舒巴坦耐药率最低，其次是亚胺培南，再者是头 抱他啶和哌拉西林/他唑巴坦。产OXA2 23型B2内酰胺酶是鲍曼不 动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因。周敏等的研究也显示携 带OXA-23型碳青霉烯酶基因的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药的 耐药率高其编码基因为blaOXA-23。另外，胡源等的研究表明碳青霉烯酶

16、基因PCR扩增用于检测鲍 曼不动杆菌特异性较高，但如果仅从扩增片段长度判断,存在出现假阴 性的可能。在国外，Heritier等通过质粒转导的试验证实Ade-ABC外排泵系 统的过度表达联合OXA酶的表达可以共同导致较高水平的耐药可 以推断临床中产碳青霉烯酶的不动杆菌对多种药物的多重耐药可能 是由多种碳青霉烯酶共同作用并联合其他机制，例如药物靶位结合蛋 白的变异导致与药物亲和力降低、细菌外膜蛋白通透性降低等所导致 的高水平耐药，各种耐药机制之间的协同关系仍需进一步研究。2、对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究进展肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneum oniaecarbapenemase , KPC酶)最早在一株亚胺培南耐药的肺炎克 雷伯菌中被发现。从2000年以后,KPC酶家族陆续在美国的新英格 兰和亚特兰大地区被发现,主要在克雷伯菌属中，也在其他菌株中被 发现。由于肠杆菌是临床上重要的医院感