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1、染色体步移步骤染色体步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1 .根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2 .步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3 .鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4 .用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5 .用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。
2、其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物(SP Prime。，与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR反应。现在有很多Genome Walking Kit,相应的说明书都介绍的很详尽，下面给你发一个原理图：引物设计结合原理：未知序列区n未知序列区I已知序列区AP1 PrimerSP3SP2 SP1第一次巢式PCR反应;（引物为 SP1 和 AP1 Primer）AP1 Primer: =1SP1 Primer: .首先进行五个高退火温度的高特异性反应 然后进行一个极低退火温度的低特异性反应J进行热不对称PCR反应首先进行2个高退火温度（一般65）的高特异性
3、反应共进行15 然后进行1个低退火温度（一般44F）的低特异性反应个大循环第一次巢式PCR反应产物如下;特异性产物一，含量较低 非特异性产物I*含盘较高 非特异性产物11一，含量较高第二次巢式PCR反应:污 I 物为 SP2 和 AP1 Primer）进行热不对称PCR反应AP1 Primer; = SP2 Primer:首先进行2个高退火温度（一般65七）的高特异性反应一共进行15 然后进行1个低退火温度（一般44 C）的低特异性反应个大循环第二次翼式PCR反应产物如下;特异性产物-含吊很高 非特异性产物I含量很低 非特异性产物H,含量很低第三次巢式PCR反应；（引物为 SP3 和 AP1
4、Primer）进行热不对称PCR反应首先进行2个高退火温度（一般65七）的高特异性反应扶进行15然后进行1个低退火温度（一般44C）的低特异性反应一个大循环AP1 Primer特异性产物-含量非常高 三T二二SP3 Primer图1. Genome Valking Kit的实验原理图大致的原理是这样的，依据 TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下:1.基因组DNA的获取。基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组DNA （例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。止匕外，由于本方法灵敏度极高，模板
5、DNA 一定不要污染，所需的DNA量不要少于3仙名2 .已知序列的验证。在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于 500 bp）,对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。3 .特异性引物的设计。根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3o4 . 1st PCR 反应。基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA量并不相同，实际用量参考下面的注*1）,以AP Primer （四种中的任
6、意一种，以下以API Primer为例）作为上游引物，SP1 Primer为下游引物，进行1st PCR反应。按下列组份配制1st PCR反应液。Template (基因组 DNA ) x ng *1dNTP Mixture (2.5 m M each 8 口10LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 lTaKaRa LA Taq ? (5 U/ 位 10.5 a lAPI Primer (100 pmol/ X 11 plSP1 Primer (10 pmol/ X 11 ldH2Oup to 50 口1st PCR反应条件如下：94 c 1 min98 c 1 min9
7、4 c30 sec6068 c *2 1 min5 Cycles72 c 24 min*394 c30 seq25 c3 min；72 c24 min*394 c30 seq6068 c *21 min；72 c24 min*394 c30 seq6068 c *21 min；72 c24 min*315 Cycles94 c30 seq44 c1 min；72 c24 min*3 72 c 10 min5 . 2nd PCR 反应。将1st PCR反应液稀释11000倍后，取1仙祚为2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物，进行2ndPCR反
8、应按下列组份配制2nd PCR反应液。Template （1st PCR反应液）1 仙 l *4 dNTP Mixture (2.5 m M each) 8 l10LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 lTaKaRa LA Taq ? (5 U/ 位 10.5 lAPI Primer (100 pmol/ X 11 plSP2 Primer (10 pmol/ X 111dH2Oup to 50 口2nd PCR反应条件如下：94 c 30 sec6068 c1 min*2 ;72c 24 min*394 c 30 sec6068 c1 min*2；72 c 24 min
9、*3 15 Cycles94 c 30 sec 44 c1 min ;72 c 24 min*372 c 10 min6 . 3rd PCR 反应。将2nd PCR反应液稀释11000倍后，取1仙祚为3rd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物，进行3rdPCR反应。按下列组份配制3rd PCR反应液。Template （2nd PCR反应液）1 仙 l *4dNTP Mixture （2.5 m M each）8 l10LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 口TaKaRa LA Taq ? (5 U/ 位 10.5 口API
10、 Primer (100 pmol/ X 11 仙 lSP3 Primer (10 pmol/ X 111dH2Oup to 50 p l3rd PCR反应条件如下：94 c30 sec6068 c *21 min；72 c24 min*394 c30 sec6068 c *21 min；72 c24 min*315 Cycles94 c 30 sec 44 c 1 min；72 c 24 min*372 c 10 min7 .取 1st, 2nd, 3rdPCR反应液各5口使用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳。8 .切胶回收清晰的电泳条带，以 SP3 Primer为引物对PCR产物进行DNA测 序
11、。染色体步移的注意事项* UMLEK 甲现号QTAUCIW）引物跣计（力特异嵌套弓I物与筒并引物的退火泡更要求至少相差10嗖以h简并引物：按照物种普姻存在的蛋白段的保守狐基酸序列设认一痴峋并引物；筒并引物相对较 &长度为14 bp退火温雌） ,要考虑倒谶并性口为了勒晌井引物与目标序列间退火的可能临除 了3端的S个碱基以外，其它位置的嵋包含他井核甘酸.（5）特异性引物的设计；特异性引物设计示意图（以兼取5,序列为例）未就区域已知序列区AP Frif Blrtdinc Sit* * SP3 SFW SF1特异性引物根据经过验证的已知序列区（最好不少于500 bp）设计三个的性引物（虹图）：设计方向
12、为需要扩增 的未知区域方向，SP2的位置底设计在SP1的内网SP3位于$屋的内掠每两4sl物之间的距离没有严格 规定，f 以66100bp为宜n引物设计原则：引物的长度为2226瓶GC含量将55狗Tm（帧70七， 引物Th也il篁公式:TmW83+0.41CGC 如100-65。儿引物城基数在设计卷异性引物时,SP3用 而 不理用离未知序列区域太远，TR以100用为宜，以增M糊味知序引物设计列的有效长度.其他要 求和普迪PCR反I、眺引物相也2） 1PCTO引物相为电福已将算引物应领较低硒工而新并引物的浓胭疏，T&为2. 5-5. OprnML以满 足引物的结合妓串.龄横*的鞫邦格敷根据需要格
13、上一 wo诚胸液稀帮 Torn 辰 取1西为榄札地悄先建被使腓（尔反攻原就甲 作为模ft进行PCR反瓦如果PCR扩增效果不理想.可遍与稀附GR反/那涵酗加7PGR反麻 适洋内可以摸索一个情择微fit的梯蜃来硝定最佳的稀释（辙二4） 鹿#精异性引聊储浴I物的选择直谶响扩酗效果.加味不黜脚鬻意的扩峭果，具峋读在预备实 验巾重新设“特册用物或者突用其它的胸井物.EJLPCR反应中，后将发#1循环的退火温1克设为65七左右.鼓低将件件循环的退火温度设为44c T d断寺异性循环的退火温度说在庙严糕的W坏中,四火温度强尽可能高，tWHlWlTm 世嘤高1图虻可根掷需要恍提延伸忖间，延侧向长可以疑取今受长
14、的DNAT段，但是容易产生，的舁榭PCRT增： 推荐延伸时间为2 min.5） TAILPCR产物分析在多教情况下，第T反应有较多的非特异性产物场图9与图1Q所示兀由卬1和AD为闻物犷用出的神异性片段在第轮反就中由于量小而不一映出蒸当唧2替代甲晦行但啦阳3, T1附 异性和踊失，播异性的产物粒选雌地历增而显凰欲增加嶙嘛麻肆第可期肥置海砂设黄为反力产期的热不对称的瑜也由于秋阚铝I物胜第T反鹿中TM、能护造到可施检遍的水王田比可以省第 嘀黑胶屯泳分析，仅仅松u倒n&和第二:而狗来振得特异性的目标片段,取第第 二和.第三轮反应，.物成批占博.南,他舁弓I檄是嵌套的，国此阵异均坐拙赭峰二施曲犷物小F 驾一轮反扁产班不同的AD引物的犷物蟀不同.有黑的俄IFCR犷喇I的目标片段的大小闹蜥250bp2kk出皿引物在特算性引物的下的谆小鼠幽M同心标I网有时会产生4以上不同即你鼬舁性片段他阍10所云），这时可以滋择地强爆BJ片堰边行后唉/脸处用1: IHind m digest2: 1atpcR:扩增产物3: 2nd PCR扩增产物4: : 3rd PCR扩增产物5i DL2.000 DNA Marker朋 TA1LB& 看见忖分新1W三次P6扩增结果均显示蒯磔花 是由M潞三
