《清蛋溶菌酶的研究--毕业设计.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《清蛋溶菌酶的研究--毕业设计.doc（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、太原工业学院毕业论文1 前言1.1 溶菌酶溶菌酶(Lysozyme, EC) 又称细胞壁溶解酶（Muramidase）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在 1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真
2、菌细胞壁溶菌酶。根据作用位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间 -1, 4 糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图 1-1。根据来源不同可分为：T4 噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：C 型(chicken-lysozyme type)、G 型(goose-type)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。本
3、文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即 C 型溶菌酶。图 1-1 胞壁质水解酶的类型及其水解位点Fig 1-1 Types of Murein hydrolases and their catalytic sites on peptide.1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。当有EDTA存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末 ,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白
4、的 3.4%3.5%，由 18 种 129 个氨基酸残基组成，分子量为 14.4 kDa，等电点为 11.1，最适温度为 50 ，最适 pH 值为 67，其化学性质非常稳定，在 pH1.211.3 范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也比较稳定，在 pH47、100 处理 1 min 后活性基本不变，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下热稳定性较差。1.1.2蛋清溶菌酶的结构和功能蛋清溶菌酶的构象比较复杂，-螺旋仅占 25%，同时存在着伸展的 -片层结构，其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，溶菌酶的分子结构见图 1-2。图 1-2 溶菌酶的分子结构示意图Figure 1-2
5、 Molecule structure of Lysozyme. 它具有 4 对二硫键(6Cys127Cys, 30Cys115Cys, 64Cys80Cys 和 76Cys94Cys)，这几对二硫键在经变性剂或热处理后均能保持稳定，但是很容易被还原剂破坏溶菌酶的活性位点为 35 位的谷氨酸(Glu35)和 52 位的天冬氨酸(Asp52)。一般认为蛋清溶菌酶具有胞壁质酶活性，即通过活性中心 Glu35 和 Asp52 的作用，催化水解 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 -1, 4 糖苷键。Glu35 作为糖苷键的质子供体，剪切底物的 C-O-C 键，Asp52 处在一个明显的极性环境
6、中，参与生成糖基酶中间体，然后与水分子发生反应，水解生成产物。溶菌酶通过此胞壁质酶活性，破坏细胞壁的肽聚糖，导致细菌细胞壁的逐渐瓦解，内容物外流，从而最终导致菌体死亡。1.2溶菌酶的应用1.2.1 溶菌酶在食品工业上的应用溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度（通常为0.05%）的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐、保鲜的作用。用于新鲜海产品和水产品的保鲜一些新鲜海产品和水产品在0.05%的溶菌酶和3%的食盐溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行常温或冷藏贮存，均可延长其贮存时间。在糕点和饮料上的应用在
7、糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶也可起到一定的防腐作用。在pH值6.07.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。在保健食品添加剂上的应用溶菌酶是高盐基蛋白质，具有一定的保健作用；有抗感染及抗生素效力增强作用，有血液凝固和止血作用，有组织再生和形成促进作用等。1.2.2 溶菌酶在生物工程上的应用溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰氏阳性细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取。只要把对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、
8、冷冻离心等手段，就可以得到无细胞提取液，进一步精制，可以得到所需菌体物质。因此，生物工业的发展对溶菌酶制剂的需求量将与日俱增。1.2.3 溶菌酶在发酵工业上的应用酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。 它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。此外，溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。将对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段，就可以得到无细胞提取液，进一步精制，可得所需的菌体物质。1.2.4 溶菌酶在医学上的应用血清和尿液中的溶菌酶对一些疾病诊断是
9、有帮助的，或者可以在疾病过程中作为一个标志性的物质。血清溶菌酶水平对白血病的诊断起到辅助性作用。在尿中，正常情况下只发现了少量溶菌酶，因此，测量尿中溶菌酶，对患有肾病的病人，特别是那些与肾病有关的肾小管功能障碍疾病的评价是有帮助的。此外，尿中的溶菌酶含量的变化有助于移植排斥、烧伤严重程度的判断，因为烧伤病人分泌的溶菌酶明显增多。角膜结膜炎干燥引起的泪腺退化不仅导致眼泪的减少，而且也降低了眼泪中溶菌酶的浓度。脑脊髓液中溶菌酶的增加被称为是炎症和中枢神经系统疾病的敏感信号。1.2.5 溶菌酶在科学研究中的应用由于溶菌酶具有能够专一性地分解细胞壁的能力, 除了在实际生产中的应用外, 溶菌酶更广泛地应
10、用于科学研究中。 如利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领域。在环境污染日趋严重的当今世界，在倡导绿色食品的今天，溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。另外，由于人溶菌酶在参与机体的防御机制，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节等方面的作用具有其他来源的溶菌酶无法比拟的优势，具有可观潜在的临床应用价值。因此，有关人溶菌酶的应用研究以及如何实现工业化生产已引起广泛重视。采用当前的基因工程技术，利用原核或真核生
11、物作为寄主细胞，从而为实现大规模生产人溶菌酶提供了可行性途径，这必将把溶菌酶的研究利用推入一个崭新的阶段。1.3 溶菌酶与细菌相互作用的研究进展1.3.1细菌细胞壁结构细胞壁是存在于原核细胞、真菌藻类、植物细胞外层的一道屏障。细胞壁可抵抗渗透压，保持细胞的完整性。根据革兰氏染色反应，可将细菌分为两类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。它们的细胞壁组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁仅由肽聚糖层构成，肽聚糖的层数较多，厚度约为 2030 nm，且交联度高，并含有少量的磷壁酸，所以常用溶菌酶水解革兰氏阳性菌的细胞壁，从而获得原生质体。革兰氏阴性菌细胞壁分为内外两层(图 1-3)，即外层脂多糖层和内层肽聚糖层。图
12、 1-3 革兰氏阴性菌细胞壁Fig.1-3 The cell wall of gram-negative bacteria大肠杆菌(Escherichia coli)是一种典型的革兰氏阴性菌，脂多糖分布在它的细胞壁最外侧。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外侧特有的结构和功能分子，由三部分组成，伸展在最外面的是由重复性糖单元构成的亲水性的 O-抗原(部分菌没有)，中间为核心多糖，最内侧为疏水性的类脂 A。脂多糖和磷脂单分子层构成了细胞的外膜。在细胞外膜之内是一层很薄的肽聚糖层，由于肽聚糖处于细胞壁的内层，溶菌酶必须越过细胞外膜才能作用肽聚糖层，所以溶菌酶对革兰氏阴性菌作用效果不是很明显。1
13、.3.2 溶菌酶对细菌的抗菌作用溶菌酶一方面具有胞壁质酶活性，即能水解肽聚糖中的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 -1, 4 糖苷键，引起细胞裂解。另一方面，近年来的研究发现，溶菌酶具有阳离子抗菌肽活性，它独立于胞壁质酶活性而存在，主要与溶菌酶的结构，电荷分布，表面疏水性有关。Ibrahim 在 2001 年研究发现了鸡蛋清溶菌酶(HEWL)的抗菌活性独立于它的胞壁质酶性质的遗传学证据。通过将蛋清溶菌酶的关键催化残基 Asp52定点突变成 Ser，构建胞壁质酶性质失活的溶菌酶 D52S-Lz，来说明溶菌酶的胞壁质酶性质对革兰氏阳性菌的抗菌作用。结果显示，突变溶菌酶 D52S-Lz 与
14、野生型的溶菌酶并没有结构上的差异，它失去了溶菌酶的胞壁质酶活性，但抗菌活性与野生型的相同。随后，Ibrahim 通过水解溶菌酶得到一种具有抗菌活性的短肽，它存在于蛋清溶菌酶中的helix-loop-helix (HLH)基序结构区域中，此区域位于活性位点裂缝上游，这进一步说明溶菌酶还具有抗菌肽活性，此抗菌肽活性与它的结构有关。1.3.3 细菌对溶菌酶的抵抗作用虽然大多数的革兰氏阳性菌对溶菌酶比较敏感，但是一些致病菌的特定菌株，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC35556、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)Scott A却对溶菌酶产生
15、了抗性，而有些革兰氏阴性菌反而对溶菌酶敏感，如Serratiamarcescens ATCC 8100。图 1-4 蛋清溶菌酶和葡萄球菌肽聚糖联结位点相互作用假定Fig. 1-4 Proposed interaction of the binding groove of the egg-white lysozyme and staphylococcal peptidoglycan近年来的研究发现，细菌抵抗溶菌酶作用的机制大体可分为两类：一类是细菌细胞壁自身成分的修饰；另一类是细胞壁中存在溶菌酶抑制剂。细菌的成分修饰主要体现在一些革兰氏阳性菌中的肽聚糖修饰，主要包括O-乙酰化修饰和磷壁酸修饰。O
16、-乙酰化修饰通过O-乙酰转移酶A对N-乙酰胞壁酸的C-6残基进行O-乙酰化修饰，从而对溶菌酶活性位点形成空间位阻。磷壁酸修饰通过dlt操纵子操纵形成的产物对细胞壁的磷壁酸进行D-丙氨酸酯化和N-乙酰葡糖胺残基修饰，修饰后的磷壁酸与胞壁酸的C-6残基相连。如图1-4示。溶菌酶抑制剂主要存在于部分革兰氏阴性菌中，它们能与溶菌酶结合而对溶菌酶的水解活性有抑制作用。2001 年，Monchois 首次发现 E. coli 中存在的 lvy 基因编码产物对C-型溶菌酶有很强的抑制作用，接着人们对它的功能进行了一定的研究。随后在 Shigella flexneri，Yersinia enterocolitica 和 Pseudomonas aeruginosa中也发现了
