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1、http:/ 首发于 蒲公英论坛 制药技术的传播者，GMP理论的践行者 知识如氧气无处不在，沟通如呼吸轻松自然1. 生孢梭菌 在液体培养基中用微量移液管传代、计数，菌落为小灯笼状。其它用接种环。2. 污染的生长快慢与微生物所处的不同生长时期有关（休眠期，对数生长期，稳定期，衰亡期），被检出的时间早晚可能不同，不一定“较早检出的是QC污染，较晚检出是冻干产品问题”。3. 阴性对照最好包含每一瓶瓶底的稀释液、培养基；每张膜的重新量不超过1000ml也不是绝对强制，只要验证了合适就行；溶解和稀释尽量选择对微生物有修复作用的0.1%蛋白胨水溶液，除非不能溶解。4. 培养基制备要看说明书，有些只需要煮沸
2、就是灭菌了，有些在固定的时机加添加物。5. 已灭菌培养基一般不超过1周，但也要验证，验证出更长时间也是可以的(但不得超过3周)。6. 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的衍生物可作为工作菌株。7. 生物指示剂原有生物负荷可能不合格，若多次按厂家要求方法检测不合格，应考虑更换供应商。8. 需要建立带菌物溢出处理的管理规程，通常可使用0.1%升汞、福尔马林、75%乙醇、0.2%新吉尔灭、石炭酸等圈起覆盖处置。9. 培养箱既是设备也是环境，要消毒、定期记录温度，最好配备UPS。10. 沉降菌的预培养在C级背景下是可以的；阳性室的衣物要包裹后传出灭菌后再进行其他处理。11. 生物安全柜中为特殊风向流形
3、，不能使用酒精灯以免破坏风形影响对人的保护，应配置红外灭菌器。生物安全柜为A2（class II）负压型（至少70%外排），应检查各报警组件的有效性。生物安全柜内物品摆放应有图片示意，放在操作区周围或后面，避免摆满。12. 应配备厌氧培养的环境（厌氧培养罐或培养盒）。13. 无菌/微生物检验方法学在没有任何变更的情况下可以有选择性的选取某种菌再验证一下，以保证该方法在不同批次原辅料间的检出能力。14. 2010版药典第二增补本已经刊印，要以意见稿为蓝本，买东西、准备验证，以免增补本实施时没有进行相关验证。15. CMCC（中国医学菌种保藏中心）提供的菌种为减毒菌种，但保藏不当也可能发生实验室感
4、染。16. II级生物安全实验室防护的目标是：保护操作人员、样本、环境。17. 要学习病原微生物实验室生物安全管理条例。18. 阳性菌、检出菌的分离、鉴定要在生物安全柜内进行，且阳性间应能自动关闭，门锁易于打开。19. 新建微生物实验室阳性间必须和其它房间不得共用一套空调系统；现有的共用系统最好单独送风，阳性间经高效过滤后排放，且生物安全柜也要高效过滤后排风。20. 阳性间30米内配备洗眼设备，实验室应配备急救箱（化学实验、其它常规实验）。21. 阳性实验室要张贴黄色生物危害标识。22. 需要进行膜完整性测试（每批滤器和每批实验室用滤膜）。23. 需要进行六步脱阳性间手套、3区划线及阳性间作业
5、的培训（含尖锐物的包裹、避免工作中产生气溶胶、平板打开方向/角度等）。24. 噬热脂肪芽孢杆菌 用于湿热，枯草芽孢杆菌黑色变种用于紫外消毒，金葡和枯黑用于化学消毒剂的指示菌。25. 化验室环境监测包括表面接触和手套接触菌，记录中应添加。26. 阳性对照菌的选择依据是：样品对这种菌的抑菌作用最强。27. 应注意无菌直接接种法的方法学验证 接种菌的ml数不超过培养基量的10%（查一下化验室的验证报告）。28. 第32页左下表的要求应体现在SOP和验证中。29. 批产品的检验量冻干产品应按固体计算，每批检量应为10支，分半量和全量（液体制剂也有这种情况，注意半量和全量的区别，尤其是举的例子）。故而，
6、目前的检验抽检率处在高水平，尤其还有上下层。但50mg300mg这一段的取样量应是半量法，目前公司为全量，虽然不合规矩，但检出概率高，应该没事。若不能实现即时转移样品溶液，可转入灭菌的瓶子中。30. 不管哪种无菌检查法，只要每个容器供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐和改良马丁两种培养基；无菌附录表2中所示为最小检验量，但只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。31. 微生物检验方法验证中，（肠溶供试品应使用pH6.8无菌盐酸盐溶液制备，查一下），计数方法验证时，各试验菌的回收率逐一进行验证，验证试验至少进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次的回收率
7、。32. 微生物检验方法验证中计数方法验证有平皿法、培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法、中和法。应注意平皿法1:10供试液1ml和试验菌（50100cfu）注入平皿，制备两个；培养基稀释法采用5皿或10皿（每皿样品0.2ml或0.1ml）；每株试验菌2皿；薄膜过滤法取1:10样品液1ml。33. 控制菌检查法验证中，大肠埃希菌、大肠菌群的阳性使用大肠埃希菌，沙门菌使用沙门菌，以上为口服用；铜绿、白念、金葡为对应阳性菌，梭菌使用生孢梭菌做阳性菌，这些为外用的对照菌。阳性对照取规定量供试液10ml和10100cfu试验菌实验。34. 应注意对菌的鉴定和确认应联合使用生化鉴定的方法。35. 第49
8、页的中间表格是抗生素和敏感菌株的对照表。下表验证失败原因操作人员要掌握（菌种定期传代，使用不超过5代，专人制备菌液以保证浓度，消除样品抑菌作用，加菌操作确保摇匀，加菌操作要迅速以免生长抑制）。36. 验证怎么做的操作规程就要怎么做，如冲洗液验证时用0.1%蛋白胨600ml，则检品检验时也要这样做。37. 抑菌效力试验中，制剂中的抑菌剂的量应为最低有效量，且最终包装中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害浓度。（消毒剂消毒效果/残留验证可是当参考该原则）38. 菌种保藏的目的是使菌种不死亡、不生长、不污染、不降低或丧失其优良性、尽量延长使用时间。39. 菌种的保藏方式和效期必须经过确认（至少包括形态、
9、镜检、联合生化试验）。菌种保藏最好配备UPS。40. 第77页中间表格“菌种保藏要求”详细讲。41. 菌种保藏可采用磁珠冷冻保存法，通常验证结果能够保存一年，个别菌另当别论。42. 黑曲霉菌：3天时斜面变白色，4天左右变成棕黑色，57天时变成黑色。43. 菌种运输时，尤其是斜面菌种要加冰袋运输。44. 商品干粉培养基每批做一次灵敏度，每次配制时检验无菌性。45. 阴凉干燥的干燥是指不适宜人的舒适性（50%60%）定义的，50%以下就是干燥。46. 紫外灯是表面消毒，受面积、能量、距离影响，O3消毒是空气消毒，甲醛消毒要至少24小时排尽，还要加氨气中和，而且对菌有损伤，实验室不建议使用。47.
10、新建实验室的阳性间和空调系统必须独立送风，现有的系统不具备此条件也要确保独立的送风管道送风，且阳性室要过高效后直排；而且最好先进行无菌、微生物、沉降菌等试验，之后再去另一个房间做阳性。48. 取样工具现用现灭，要不就要进行效期考查。49. 培养基灵敏度测试是在一定配制、溶解方法和灭菌条件下来达成其营养状态保持的效果评估。50. 胆盐乳糖培养基中的去氧胆酸钠有抑制G+菌的作用，故而用于生化鉴别实验。51. 大肠埃希菌在伊红美兰琼脂培养基中先产酸然后作用于伊红美兰生成紫黑色金属光泽菌落。52. 被检样品中可能存在优势菌或弱势菌，所以使用对大多数菌有生长促进能力的营养琼脂，而不是选择性的培养优势菌，
11、以避免假阴性。53. 培养基适用性检查的内容：培养基质量（营养成分）、配制过程（水、重量、pH、分装、灭菌）、保存条件（温度、容器、时间）、培养基使用（融化条件），也就是不仅考察培养基，也同时考察了使用方法。要去”查看”性状,“审核”成分。54. 培养基灭菌后取出时，压力为零，温度低于90取出，不要快速降温，防止负压造成微生物侵入。同时，胆盐乳糖培养基还要防止跳塞的情况。灭菌后培养基一般保存3周，但要经过验证，同时也不可以超过3周的法定最长期限。55. 培养基适用性检查选取的是自然界常见的六种菌：金葡（G+）、铜绿（G-）、枯草（好氧芽孢）、生孢梭菌（厌氧）、白念（酵母菌）、黑曲（霉菌）。56
12、. 培养基适用性检查一定要注意培养基体积和加菌量（菌量体积不超过培养基1/10）57. 计数培养基的适用性检查之所以加菌50100cfu是因为计数方法有不确定性，100cfu时标准偏差30%，回收率70%（数学上没理解，但记下来了）58. 控制菌的促生长能力实验，在规定的最短时间下培养是指：如规定培养1424小时，则18小时就要产生阳性现象。指示能力在规定的时间内指：若规定1424小时，则24小时就要产生阳性现象。指示能力在规定的最短时间下，与上述促生长实验的时间计算方式相同。抑制能力在规定的最长时间下，如大肠用胆盐乳糖培养基1824小时，必要时至48小时，则此处最长时间就用48小时。59.
13、控制菌培养基适用性检查时固体的平板要平行两份，数量形态尽量一致，液体的不用双份。60. 专业人员要掌握各培养基对应的指示、促生长、抑制的所用培养基类型。61. TTB中含CaCO3，促生长实验48时可能有沉淀，不利于菌检出，可讲TTB中产物转入胆盐硫乳中划线培养，对照菌也同法操作，只要形态、数量上被检和对照一致，则可反正结果有效。62. 偏差相关：62.1 许可的复验也要有一定的批准程序。62.2 制药用水、环境采样等样品要规定检验的最长时限。62.3 微生物、无菌的调查除非证明实验室有问题，否则，没有必要复检了，这是最新理念，这就要求对生产环境、检验环境的菌要纯化、选出优势菌保存，以作长期对比。63. 检验方法：63.1 清洁验证的检验方法验证一定要做“范围”，确保待检浓度在范围内。63.2 药典升版的确认要有个计划，甚至在药典标准公示阶段就要开始。64. 现场教学：64.1 培养基三区划线（液体、固体）64.2 斜面穿刺，划线。
