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1、DNA重组技术实验原理、方法和步骤实验原理1DNA重组技术 重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤： 1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2、2）将重组DNA分子转化宿主细胞。 3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。 4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。图1 TA克隆原理示意图2质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.012.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环
3、质粒（CC）DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。3质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：、型。型切点不固定，型其切割位点在识别位点之外，只有型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均为型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的
4、特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状DNA（DNA分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定以下格式固定：标题原理操作步骤注意事项 试剂货号公司。添加试验失败结果的照片。加入实验原理所有实验，进行前请认真阅读试剂使用说明书关键的准备工作，如试剂选择等（提前预热/预冷相关仪器等）注意事项附在相应操作步骤之后，以五角星标注。一 RNA反转录cDNARNA防污染措施实验原理：RT-PCR是将R
5、NA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。实验材料：试剂盒：Takara PrimeScript RT reagent Kit实验步骤：实验所用枪头，EP管，水等全部使用RNase free耗材，或者提前使用DEPC处理。处理方式：按照1/1000比例向无菌水中加入DEPC，将所需耗材在含DEPC的水中
6、浸泡过夜；次日早晨高压灭菌处理。提前调水浴锅至42；按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。5PrimeScript Buffer(for Real Time) 2 l PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 l Oligo dT Primer(50 M) 0.5 l Random 6 mers(100 M)0.5 l Total RNA 360ngRNase Free dH2O up to 10 ltotal10l轻柔吹打均匀；室温放置10min；42水浴锅中放置1h；冰中冷却2min；注意事项：上述反应可根据条件在PCR仪中进行。当需要使用的基因编
7、码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将 RNA 溶液于 65C加热 5 分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。二 目的基因扩增：引物设计原则：a) 特异性：在cDNA中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast检验）b) 在引物5端添加酶切位点及3个保护碱基设计引物时，保护碱基应加到5-10个李积彬；c) 酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使用平末端位点；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用primer premier对序列中的酶切位点进行分析。d) 设计引物时建议同时设计合成两对或两对以上引
8、物，以免一对引物扩增失败时，再合成第二对引物浪费时间。三 PCR反应优化PCR反应条件，使扩增的目的片段更为特异李积彬：实验原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合
9、酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。实验材料：dNTP,PCR buffer,DNA聚合酶，上游引物，下游引物，纯水，模板。操作步骤：拿到新合成的引物后，按照引物说明书离心，溶解引物至100Mm。使用时稀释至10mM。将（Tm-5）作为退火温度进行PCR反应并对PCR产物进
10、行琼脂糖凝胶电泳鉴定。如果存在非特异条带，一般会设置退火温度梯度，摸索最适退火温度。（Tm-5）不是一个普适的规律，最好不要太依赖。4k以下的片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作即可；如果4k以下的片断用KOD Plus扩增效果不佳，可以换用KOD FX。四 PCR产物回收对于在细胞系中突变可能性比较大的基因，可以考虑将多种细胞系的RNA或cDNA混到一起作为模板进行扩增。mRNA不同剪接体的选择，根据文献中报道的以往研究来选择自己要研究的剪接体。使用的模板需经过质量鉴定，比如进行琼脂糖凝胶电泳鉴定片断完整性。：实验原理：在高盐状态下，
11、纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。实验材料：OMEGA cycle-pure kit,OMEGA gel extraction kit取5微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果产物为单一条带，且大小符合预期，直接进行PCR产物回收。如果存在非特异条带，可以考虑进行胶回收，或者继续优化PCR反应条件。配制1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入100ml TAE溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。待温度降至60C左右时(刚好不烫手)加入10l 4S green，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷凝后备用。将反转录样品与Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加
12、Marker，固定电压180V，跑20分钟左右。此时调水浴锅60C .操作步骤：参考意见：500bp以下的片段使用2%琼脂糖凝胶；500bp以上使用1%琼脂糖凝胶。标准并不绝对，可以根据个人经验进行调整。在紫外灯下切下相应大小的DNA片段，加入EP管内，按照0.1g凝胶加入100l的比例加入buffer xp，放入60C 水浴锅中至胶完全融化。这段时间组装收集管与吸附柱，并在吸附柱上做好标记。紫外照射时间不宜过长，避免DNA形成TT二聚体。用大枪将EP管内溶液吹匀，吸入吸附柱中，12000rpm离心1min；倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入300l buffer XP，最高速离心1min，倒掉
13、收集管中废液，向吸附柱中加入700l wash buffer，最高速离心1min；重复上一步骤。最高速空转2min；取出吸附柱，放入新离心管中，70加热2min，待乙醇挥发；向吸附柱中加入50l超纯水，70加热2min，12000rpm离心1min，离心管内液体即所需回收的DNA溶液。五 PCR产物与载体的酶切实验原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:类、类、类。类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位
14、点上切割DNA分子，然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为 4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA段(如Sma :5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补
15、的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC33CTTAAG 5 3 CTTAA G5DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。操作步骤：使用takara quick cut限制酶或常规限制酶，酶切体系及条件见相应酶的说明书实验中发现快切酶切割效率低的现象。如果可以找到合适的buffer，建议用常规酶进行酶切。酶切部分写详细。Buff
