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1、1 引言1.1 蒽醌介绍蔥醌类（AnthraquinoneS化合物是一类广泛存在于自然界的重要天然色素，在细菌、低等植物的真菌、地衣和高等植物中都有分布。致泻作用是蒽醌类化合物主要的 生物活性。例如中药大黄的致泻作用早已被人们熟知。 蒽醌类化合物大多具有一定的 抗菌活性，苷元的活性一般比苷类强。如大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等对多种细菌 具有抗菌作用。某些蒽醌类成分还具有抗真菌活性。除上述两种生物活性外，有些蒽 醌类化合物还具有较广泛的其它方面的生物活性。如对小鼠黑色素瘤、大鼠乳癌及艾 氏腹水癌有明显的抑制作用，对 cAMP 磷酸二酯酶有显著的抑制作用，对异常高的免疫 反应有强烈的抑制作用。在高
2、等植物中，葸醌类主要分布在蓼科、茜草科及豆科等 30 余科植物中。蒽醌类 成分包括蒽醌及其衍生物、还原产物，其中蒽醌又可分为大黄素型和茜草型。大黄素 型蒽醌包括大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等，其分子中羟基分布在蒽醌中苯环两侧， 主要分布于蓼科与豆科等植物中。茜草素型总醌的羟基分布在蒽醌分子一侧的苯环上， 主要分布于茜草科植物中。蒽醌具有明目、降血脂和胆固醇、抑制动脉硬化与脂肪肝 形成、降血压、缓泻和润肠通便、利尿、抗氧化和过氧化作用、抗诱变和保肝等多种 功效。1.2 化学性质蔥醌不易被氧化，能发生硝化、磺化和溴化反应。如果向反应体系中加入HgSO，则蔥醌磺化几乎都是a -磺酸，继续碘化可得到1.
3、5-及1.8-二磺酸，1， 46-、1， 7-蔥醌二磺酸是分两步磺化来制备的。例如，在蔥醌磺酸中，磺基因受两个羰基的作用，而有一定的活泼性，如磺酸基可被-X、-NH、-OH等置换。2例如，p -蔥醌磺酸与NaOH和KNO共熔，生成1.2-二羟基蔥醌，即茜红素，3它是一种红色的植物染料，它可以从茜草根中分离出来，是红色针状结晶，熔点为289C ；它是最早的人工合成的天然染料。结构：分子式：C1HO4822 生物反应器培养决明发根生产蒽醌类化合物2.1 决明子简介决明子为豆科植物决明(Cossia obtusifoliaL.)或小决明(Cossia tora L.) 的成熟种子，属卫生部批准使用的
4、药食两用植物。决明子为中国药典收载的常用中药， 含氨基酸、微量元素、维生素 A 等多种营养成分，还含有多种活性功能成分，具有清 热明目，润肠通便之功效，并且具有降压保肝、增强机体免疫、抗衰老等多种生理活 性。植物形态，一年生半灌木状草本，高12m。羽状复叶互生；小叶3对，倒卵形 或长圆状倒卵形，长1.56.5cm,宽0.83cm,先端钝，基部圆形，偏斜，幼时两面 疏被长柔毛；托叶锥形，早落。花成对腋生；萼片5，分离；花瓣5，黄色，有爪；能 育雄蕊 7，下面 3 枚较发达；子房有柄，被白色。荚果线形。种子多数，菱形，淡褐色，有光泽，花期79 月，果期911 月。种子棱方形或 短圆柱形，两端平行倾
5、斜，长37mm，宽24mm。表面绿棕色或暗棕色，平滑有光泽。 一端较平坦，另端斜尖，背腹面各有 1 条突起的棱线，棱线两侧各有 1 条斜向对称而 色较浅的线形凹纹。质坚硬，不易破碎。种皮薄，子叶 2，黄色。味微苦。2.2 材料和方法供试材料为用在 MS 液体培养基中继代培养的决明发根作为大量培养的材料。2.3 培养方法和条件将生物反应器用高压灭菌锅灭菌； 3L 的 MS 液体培养基；高压蒸汽灭菌锅灭菌； 接种 18g 决明发根；调节充气量使溶解氧体积分数稳定在 20； 25 摄氏度，每天 16h 光照培养；培养过程中根据需要从添加泵流加 MS 液体培养基。从 PID 控制器联系观 察记录液体培
6、养基 ph 值变化情况；定时从取样口取出液体培养基，分析其中游离蒽 醌化合物的含量。2.4 培养基中游离蒽醌类化合物的测定决明发根的培养基随着培养时间的增长，颜色由无色、淡黄色到深褐色，逐渐加 深，提示发根想液体培养基中释放一定量的蒽醌类化合物。用分光度计跟踪测定生物 反应器培养的决明发根培养基中游离蒽醌类化合物的含量，为适时收取决明发根提供 依据。取 1,8 - 二羟基蒽醌 5.5g ，精密称定，至于 100ml 容量瓶中，加新配置的 1mol/L 的 NaOH 溶解，定容至刻度，摇匀，量取 2 ， 4 ， 6 ， 8 ， 10ml ，分别置于 25ml 容量瓶 中，用lmol/L的NaOH
7、稀释至刻度，在分光光度计500nm处测定吸光度，以浓度为 横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线，回归方程为Y=0.0361X-0.0195，相关系数 =0.9984。3 提取方法常规方法煎煮与浸渍提取蒽醌类成分效果不好，浪费药材；渗漉与回流提取法需 求大量的溶剂且耗时麻烦为了弥补常规方法中的不足，可采用连续提取法。采用此 法之前先要对药材烘烤粉碎，烘烤的目的是可以降低其结合蒽醌的含量，提高游离蒽 醌的含量，结合蒽醌主要起通便保肝的作用。粉碎是为了充分提取药物中的蒽醌类。3.1 实验仪器索氏提取器（工业器材装置与索氏提取器相似）3.2 实验溶剂无水乙醇3.3 实验原理索氏提取器共分三部分，上部是冷凝
8、器、中部是带有虹吸管的提取管、下部是烧 瓶，操作时将决明子药粉的滤纸袋放入提取管中，内装物高度不得超过虹吸管顶部， 烧瓶内加入适量乙醇做挥发性溶剂在水浴上加热。溶剂受热气化，通过中部提取管旁 边的蒸气上升管到达上部的冷凝器中，冷凝为液体流入提取管中进行成分提取，待溶 剂在提取管中进行成分提取，溶剂在提取管中凝集到一定容量，即当其液面超过虹吸 管上端时，则因虹吸作用提取管内全部溶液虹吸流入烧瓶中，流回烧瓶的溶剂可再受 热而气化，提取出的蒽醌类成分则留在烧瓶中，如此反复提取，至于植物中蒽醌类成 分提尽为止。连续提取法由于在提取过程中，新鲜溶剂不断地加入而始终保持较高的浓度差，故提 取效率高，此法仅
9、需少量溶剂，就能使有效成分提取完全。所以连续提取法可以在工 业上很好的提取决明子中蒽醌类。所得提取液进行浓缩，回收溶剂，得到提取物蒽醌 类。3.4 浓缩方法常压减压蒸馏法，薄膜浓缩法等，浓缩后可得到主要成分蒽醌类粗品，此方法 适合工业推广生产，可节约溶剂和药材，提高药材中的有效成的提取率。4 纯化4.1 盐析法4.1.1 实验原理在水溶液中加入无机盐饱和时，可使某些溶解度小的物质与溶解度大的物质分离 甚至沉淀析出，然后再对溶液进行溶剂萃取，从而萃取出较纯品蒽醌类。4.1.2 实验步骤先把决明子粗提物溶于水中，在加入足量的无机盐使其饱和，使少部分溶解度小 的物质先沉淀析出，然后过滤，再用氯仿对滤
10、液进行萃取，萃取后蒸干氯仿，干燥可 得较纯的蒽醌类成分此法的缺点是不能达到很好的纯化效果，且有机溶剂有毒不利 于安全生产。4.2 沉淀法4.2.1 实验原理蒽醌类在一定条件下可以和某些物质溶合形成沉淀物而在水溶液中与其他物质分 离，关键是选择适当的沉淀剂，已报道的沉淀剂有四类，即无机盐类，生物碱，蛋白 质类和高分子聚合物，其中无机盐类最为常用，其他三类沉淀剂成本高，目前尚处在 实验阶段，无机盐类又可分为三类：（1）重金属碱或盐，此盐重金属离子对产品有影 响，不易推广；（2）氢氧化物，这类沉淀剂廉价，但强碱对容器壁有腐蚀性；（3）盐 离子，如钙，镁，铝，锌等，是一类比较有前途的沉淀剂，较前两种均
11、有优势。4.2.2 实验步骤可以用碱式醋酸钙与蒽醌类络合形成沉淀物质，过滤出沉淀部分，水洗去沉淀的 吸附物，再把沉淀混悬与容器中，通过硫化氢气体，硫离子和蒽醌类中的络合铅可以迅速生成沉淀析出，然后过滤出混悬物，反复几次，蒽醌类中的铅被除去生成蒽醌溶 于水中，合并滤液，蒸干，干燥，即可得纯品蒽醌类。可用于提取物下一步制剂。沉淀法的优点是无需使用大量有机溶剂，生产安全性好，大多沉淀剂成本较低， 通过对比实验可以筛选出更好的沉淀剂来纯化蒽醌粗品，但重金属盐残留对产品安全 性也构成隐。4.3 分离法4.3.1 实验方法层析法又称色层法或色谱法，是分离复杂混合物的物理方法。用洗脱剂洗脱，分 离混合物中不
12、同组分关键是柱填料与洗脱剂的选择，可以用硅胶或聚酰胺层析法来 分离蒽醌类，我们也可以用磷酸氢钙装柱，用苯洗脱。4.3.2 实验原理决明子蒽醌类主要有六种化合物六种化合物各在磷酸氢钙柱层中以不同的速率 移动，分为不同的色带，阻滞力小的随着溶剂在柱层中流动，因此流程短，移动速率 快而先流出层析柱；阻滞力大的，流程长，移动速度慢，从层析柱中流出就较晚。由 此可达到分离的目的。4.3.3 实验步骤把纯制蒽醌类溶于苯中，浓缩后通过磷酸氢钙（干装）柱层析，用苯作洗脱剂， 苯展开后可分为5 个色带，继续用苯洗脱分别得到第一条色带的苯洗脱液，第二条 黄色带的苯洗脱液，第三条黄褐色带的苯洗脱液，第四条黄色带的苯
13、洗脱液，第五条 橙黄色带的苯洗脱液。第一条黄色带的苯洗脱液，蒸干苯后得到一种黄色物质，次此黄色物质溶于石油 醚，用石油醚提取得到石油醚提取部分，继续通过磷酸氢钙（干装）柱层析，这次用 石油醚展开，分为两个部分，继续用石油醚洗脱，得上面部分的石油醚洗脱液和下面 部分的石油醚洗脱液。把上面部分洗脱液中的石油醚蒸干，溶于甲醇进行重结晶可得 到单体大黄素6甲醚，5 蒽醌的检验方法蒽醌类化合物按结构的不同可分成羟基蒽醌类、氧化蒽酚及蒽酚类、二蒽酮类。 目前其提取方法主要采用溶剂提取法，如浸渍、渗漉、连续回流提取等方式，所用的 第 5页共 8页溶剂主要有乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、吡啶、丙酮、硫酸
14、溶液、盐酸溶 液及氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化铵等溶液。其含量测定方法有重量法、荧 光法、比色法、极谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法等，而单味植物药或其复方制 剂中的蒽醌化合物含量，一般以大黄素或大黄酸、1，8-二羟基蒽醌为标准测定游离蒽 醌或总蒽醌，结合蒽醌的量等于总蒽醌减去游离蒽醌。5.1 比色法根据蒽醌类及其苷大多数是黄色或橙红色的，羟基蒽醌能溶于碱溶液中而显红或 紫红色；蒽酚和二蒽醌与碱液不显红色，只能呈黄色，需经氧化成羟基蒽醌后才与碱 作用显红色；羟基蒽醌类因结构不同与醋酸镁的甲醇溶液反应可显橙、红、蓝、紫等 色的性质而比色测定。5.1.1 标准曲线的绘制取经五氧化二磷干燥 2
15、4 h 的大黄素（或大黄酸、1，8-二羟基蒽醌）对照品适量用 碱液（1 mol/L氢氧化钠溶液或其与2%氢氧化铵溶液的混合溶液）或0.5%1%醋酸镁甲 醇溶液定溶，在500550 nm波长处扫描，在最大吸收波长处测定吸收度，以吸收度 对浓度绘制标准曲线，线性范围424 “g/ml。5.1.2 游离蒽醌的测定取药物细粉或其制剂粉末适量（约相当于游离蔥醌1.5 mg）加乙醚（或氯仿）溶解 或用索氏提取器回流提取至提取液无色。将乙醚挥干，残渣用甲醇溶解，加醋酸镁 甲醇溶液至定容；或将乙醚提取液移入分液漏斗中，用碱液提取并定容 1，比色 测定，依标准曲线计算含量。5.1.3 总蒽醌的测定先水解后提取：
16、取供试品适量（约相当于总蔥醌1.5 mg），用酸液（17.5 mol/L 硫酸溶液或1.56 mol/L盐酸溶液）2030 ml2，3，4，水浴回流12 h,以使结 合态的蒽醌苷水解，使蒽醌游离，再用乙醚（或氯仿）萃取，并将过滤的药物残渣及滤 纸经50C干燥后用乙醚回流提取，待索氏提取器内提取液无色，合并乙醚液，照游离 蒽醌测定法测定。含还原型蒽酮苷（如番泻苷）的样品，根据其可被三氯化铁氧化，酸水解成氧化型 蔥醌苷元这一原理，称取供试品适量，加水30 ml超声处理1530 min（提高溶解、 提取效率，大大缩短溶解、提取时间），加10.5%三氯化铁溶液20 ml，回流2060 min， 再加盐酸13 ml继续回流30 min，放
