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1、生物技术制药：是以生物体和生物反应过程为基础,依赖于生物机体或细胞的生长繁殖及其代谢过程，利 用工程学原理和方法对实验室所取得的药物研究成果进行开发放大，在反应器内进行生物反应合成过程， 进而生产制造出商品化药物。生物技术药物：一般是指采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。生物药物：是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞体液等，综合利 用物理学、化学、生物化学、生物技术和医学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制 品。生物药物包括初级和次级代谢产物，生物体或生物体的一部分。基因工程是将不同DNA片段按照人们的设计与载体定向连接起
2、来，在特定的受体细胞中复制并表达，产生 影响受体细胞的新的遗传性状。基因工程的核心内容是基因体外重组（DNA体外重组）。 基因工程的四大要素（或基本条件）：目的基因、载体、工具酶、受体。胃化我细胞圭白产物蛭m达我沛5）r勺財细胞（干扰盍基圍）虫也旳化广DMA璽址分J基因工程诞生的理论基础 理论上-证明生物的遗传物质是DNA （ 20世纪40年代）-明确了 DNA的双螺旋结构和半保留复制机制（20世纪50年代）-明确了遗传信息的传递方式（20世纪60年代） 技术上-工具酶（限制性内切酶和DNA连接酶）的发现与应用（基因操作的剪刀，针线） -载体的发现（发现了运载工具）-逆转录酶的发现（便于真核生
3、物基因的获取，因其常有内含子，不便于操作） 基因工程制药定义:利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治 疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物，以及生物制品的一门技术。 工具酶：是指基因工程操作中所使用的核酸酶类根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶 病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好/旦在宿主B细胞中生长很差，原因是它的DNA受到宿主 B 的限制这种现象是宿主的限制与修饰,简称（ R/M 体系）。限制作用（restriction）：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA,导致噬菌体的 寄主幅度受到限制，这是维护宿
4、主遗传稳定的保护机制修饰作用（modification）：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以 修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏I型单一亚基是是核醸內切酣和 甲基化酶分开广迂使用用址不大艺U紐UM限制性内切樓酸酶类型及主要特性两种车同的亚慕序列特异的切割不是在基因工稈中的应用无用限制和慘飾活性廨蛋白分子组成规功能的3冲不同的亚基特异柱识别也点菲对称序列回文对称结构非对称序列切割位点在JE田别位査至少iOOObp悅于识别较点上距识别也点下游的览方曲机的切割24-26bpit瞅制作艸所第 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名（genus
5、）第一个字母；第二、三个字母（小 写，斜体）代表宿主菌种名（species）前两个字母。 第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母（小写，正体）或染色体外成分（质粒或噬菌体，大写，正 体）。 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示（正体）。影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素：酶的活性DNA样品的浓度 酶切反应的温度、 时间DNA的甲基化程度DNA分子的构型反应缓冲液 星号活性（是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内 切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性）II 型限制性核酸内切酶的基本特性：1. II型限制性内切酶的识别序列一般为46bp的
6、回文序列。也有6bp以上的，称为稀有切割限制酶。有 些为反向重复序列2. II型限制性核酸内切酶的切割方式：在识别序列的对称轴的5端切割，产生5黏性末端 在识别序列的对称轴的 3端切割，则产生 3黏性末端 在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端 同裂酶：是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。 同尾酶：是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连 接的一类酶。T4 DNA连接酶连接DNA/RNA杂合分子中DNA链的切口DNA连接酶：T4DNA
7、连接酶和大肠杆菌连接酶 平末端DNA片段的连接：a.直接用T4 DNA连接酶连接b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段c. 用衔接物连接平末端DNA分子影响连接反应的因素：1. DNA的浓度(插入片段:载体片段=2:1) 2反应温度(4-16C)3. ATP浓度(ATP最适的终浓度为0.5mmol/L)载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的“运载工具”，其本质是DNA复制子 基因工程对载体的要求：( 1) 在宿主纟田胞内能独立复制(2) 有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等(3) 多克隆位点(4) 分子量小( 5) 拷贝数多( 6) 具有对受体细胞的可转移性。( 7) 具
8、有较好的安全性，不能任意转移。 质粒的一般生物学特性-1质粒的分子特性- 2.质粒的自主复制性- 3可转移性- 4质粒的不相容性(又称不亲和性)- 5.携带特殊的遗传标记 理想质粒载体的必备条件： 具有较小的分子量和较高的拷贝数 ； 具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点)；多克隆位点是指载体上人工合成的含有紧密排列的多 种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 具有两种以上的选择标记基因； 缺失mob基因或nic位点； 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。入-DNA载体的构建1. 缩短长度 根据切除的多少，将入-DNA分为两大类载体：插入型载体和取代型载体插入型载体只能
9、承受较小分子量。替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入。2. 酶切位点的删除或增加3. 灭活某些与裂解周期有关的基因4. 加装选择标记 选择标记主要有两类：（ 1）免疫功能类标记（ 2）颜色反应类标记 免疫功能失活标记 （cI 筛选）1. 加装选择标记 cI 基因2. cl基因编码一种阻止入-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。3. 含有完整标记基因的入-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑；4. 当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，入-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。（2）加装选择标记 lacZ（ 蓝白斑筛选）囹Iac2基因编码B -半乳糖苷酶，能催化无色的X
10、-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中， 基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体入-DNA则产生蓝色透明斑。建立 -噬菌体的体外包装系统体外包装原理：2噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子；将这两种突变型的噬菌体的提 取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部和和尾部蛋白所需的蛋白因子。 目的基因的制备：1. 物理分离法分离技术-平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法。观察技术荧光显微镜观察。鉴定技术核酸杂交法、 Southern 印迹转移技术。2. 化学合
11、成法现在常用的方法有两种： （ 1） 全片段酶促连接法 （ 2）酶促填充法全片段薛促连按法离促壇充袪所帝專核昔啟片段的量葛因的全部募機昔酸片段基因的部分募糕昔酸片段務的种类皿戍逹接醉T4MA珪接聲大舫杆菌索合81口、負聚合酹1大片段合成基因的怅度短长，但易笑变（1/650）利用寡棄体的长度短适用性9强3. 逆转录法mRNAf cDNAf DNAf mRNAf Protein只反映 mRNA 经过加工之后的基因编码序列不含内含子 逆转录法的具体步骤：A、mRNA的纯化（寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱）B、cDNA第一链的合成（逆转录酶）C、cDNA第二链的合成（除去cDNA-mRNA
12、杂交链中的mRNA链，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链）D、cDNA的克隆和重组（D1）、用于cDNA的克隆的载体（D2）、cDNA的片段与载体的连接当cDNA的插入片段小于1OKb时，应选用质粒载体。当cDNA的插入片段大于10Kb时，应选用噬菌体载体。表达型-是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最终合成蛋白质。非表达型-是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。（ 1）借助同型多聚体尾巴的连接方法（2）加人工接头的连接法-所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶E、将重组体导入宿主细胞F、cDNA文库的鉴定表型鉴定法：（
13、1）抗性基因失活法（ 2）菌落颜色（ 3）噬菌斑颜色改变分子鉴定法：（ 1）凝胶电泳（ 2）分子杂交（3）DNA序列测定G、目的cDNA克隆的分离和鉴定核酸探针杂交法特异亲合鉴定法H、cDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术4, RT-PCR技术法PCR：是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的 分子克隆。 模板 DNA 引物4种dNTPTaq DNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。（1）变性，加热至95 C,使模板DNA解开成单链；（ 2） 退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸，温度升至72 C， DNA聚合酶以4种dNTP为底物
14、，在引物的3 -OH上，合成与模板互 补的DNA新链。5筛选新基因的其它方法鸟枪法 功能克隆法 差异显示技术鸟枪法先将供体细胞的染色体DNA,经过酶处理、或者物理学方法切割成基因水平的很多片段。将每一片段和载体进行重组。转化到受体菌中进行基因增殖。采用适当的筛选方法,从众多的菌落中选出带有目的基因的菌株。从选择出的菌株中回收重组 DNA鸟枪法的优缺点囹 鸟枪法的优点-采用鸟枪射击去命中“预定目标”的原理，该方法能够绕过直接分离目的基因的难关。囹 鸟枪法的难点-必须有一种有效的目的基因检测方法，常用mRNA作为探针，进行原位杂交法检验。外源DNA与载体DNA的切割与连接 插入灭活法例子：根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插 入重组子的菌落显蓝色 定向克隆法利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按正确方向插入到载体DNA的方法，称为定向克隆法(1) 同一限制酶切位点连接(2) 不同限制酶切位点连接优点：在连接过程中，只要外源性目的基因、载体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现象。缺点：(1)若外源性基因不能以正确的方向插入到载体之中，则重组DNA在宿主中就不能表达。( 2)反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。 载体脱磷克隆法优点：(1)载体脱磷克隆法避免了载体DNA的自身环化现象，(2)也降低了载体DNA的线性聚合现象。(
