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1、正交试验设计优化太行菊的提取工艺 张艳茹 (生命科技学院 生物工程064班) 引言 太行菊( Opisthopappus taihangensis)是菊科太行菊属的多年生宿根草本植物，多年生草本，高10-15厘米；根垂直直伸，在根头顶端发出少数1-2个或稍多数的弧形弯曲斜升的茎。茎淡紫色或褐色，被稠密或稀疏的贴伏的短柔毛。基生叶卵形、宽卵形或椭圆形，长25-35厘米，规那么二回羽状分裂，一、二回全部全裂。一回侧裂片 2-3对。茎叶与基生叶同形并等样分裂，但最上部的叶常羽裂。全部叶末回裂片披针形、长椭圆形或斜三角形，宽l-2毫米。全部叶两面被稀疏或稍多的短柔毛，基生叶的叶柄长1-3厘米。头状花序
2、单生枝端，或枝生2个头状花序。总苞浅盘状，直径约1.5厘米。总苞片约4层，中外层线形和披针形，长4-5.5毫米，内层长椭圆形，长6-7毫米，中外层外面被稍密的短柔毛，内层无毛或几无毛。舌状花粉红色或白色，舌状线形，长约 2厘米，顶端3浅裂齿。管状花黄色，花冠长2.8毫米，顶端5齿裂。瘦果长1.2毫米，有 3-5条翅状加厚的纵肋。冠毛芒片状，4-6个，别离或仅基部稍连合，不等大亦不等长，最长的达1毫米，最短的长仅0.1毫米；全部芒片集中在瘦果反面顶端，而瘦果腹面裸露，无芒片。为太行山特有属，仅有 2种， 主要分布在河北 : 邢台、武安、磁县; 山西: 陵川、晋城；河南：林县、 辉县、 济源等地区
3、，分布范围十分狭窄， 多生于海拔1000 m左右的山坡上以及悬崖峭壁的石缝中，生境险峻 ,人常难以到达植物体通体富含芳香油，干后香味持久太行菊入秋后花色洁白或粉红，花期长达 34个月， 耐旱、耐荫、耐寒,具有很高的欣赏价值和药用价值1。关于太行菊属研究集中于杂交、以及组培扩繁等方面，而对于太行菊化学成分的提取的究尚未报道234。在河南济源地区，太行菊被当地居民作为菊花代替品 ，具有疏风、清热、明目、解毒成效,且效果比菊花更好5。菊花的主要含有黄酮类 、挥发油类、酚酸类、氨基酸和糖类等活性物质67 . 据研究说明菊花脑茎叶中也含有丰富的黄酮类物质10.又有文献显示匹菊属中的藏西小黄菊的主要成分也
4、有黄酮类化合物8,而太行菊属在分类学上归为菊科菊蒿亚族9，接近分布与欧洲、北非及其中亚地区的匹菊属,据此可以初步推断出太行菊中也含有黄酮类物质。近年来对具有生理活性的黄酮类化合物的研究越来越受到人们的重视，现代研究证明黄酮类化合物是重要的抗氧化剂,其生理作用是多种多样的.例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩;杜鹃素具有止咳祛痰作用;黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用;水飞蓟素具有保肝作用等11;黄酮类化合物还有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用，是一类具有广泛开发前景的天然药物12。正是其上述生物活性引起了人们的广泛重视,对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题131415。
5、已别离得到的黄酮类化合物主要有：香叶木素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、香叶木素7o-D葡萄糖苷、芹菜素7-o -D葡萄糖苷、木犀草素7-o-D葡萄糖苷、金合欢素7- o-D葡萄糖苷等16.此外，国内也有不少研究学者对不同产地、品种或者同一品种不同采收期菊花中黄酮类成分进行了提取工艺、含量测定、质量控制等方面研究。有人采用薄层层析和比色法，对亳菊、滁菊、贡菊和杭白菊的叶及花中总黄酮含量进行测定，结果说明菊花叶和菊花中的主要成分类似17，且太行菊为国家濒临灭绝的珍贵物种,故本试验课题选取太行菊的茎叶为试验材料,提取其中的总黄酮物质.以总黄酮类化合物提取含量作为指标,研究与优化太行菊的提取工艺为对其化
6、学成分研究，质量控制同时进一步将其黄酮类物质加工成有特异功能的保健食品和药品等产品奠定了根底。1仪器、材料和试剂1.1 仪器752型紫外分光光度计上海精密科学仪器；旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；植物粉碎机；数控超声波清洗器昆山市超声波仪器。1.2 材料 试验材料太行菊Opisthopappus taihangensis采自河南省关山国家地质公园，由河南科技学院孟丽教授鉴定，标本NO.GS0901现保存在河南科技学院植物学实验室。样品置烘箱内50 60 枯燥24h, 粉碎后过40 目筛备用。1.3 试剂芦丁对照品中国药品生物制品检定所，含量测定用，所用试剂亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠为分析纯，水为
7、蒸馏水。2 方法与结果2.1 总黄酮的测定实验2.1.1 最大吸收波长的选择以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510 nm处均有1个强吸收峰，因此选择510 nm 为测定波长。 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品10.2mg置50ml容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。 标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5 ml，分别置10 ml容量瓶中，参加5亚硝酸钠溶液0.3 ml，振荡摇匀，放置6 min；再参加10硝酸铝0.3 ml，振荡摇匀，放置6 min；最后参加4氢氧化钠试液4 ml，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置1
8、5 min。采用分光光度法，在510 nm处测定吸光度，以对照品量(m1)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 黄酮含量测定方法吸取0.5 ml供试液，参加5亚硝酸溶液0.3 ml，振荡摇匀，放置6 min；再参加10硝酸铝0.3 ml，振荡摇匀，放置6 min；最后参加4氢氧化钠试液4 ml，加3O (VV)乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。采用分光光度法，在510 nm处测定吸光度值，由标准曲线计算得总黄酮含量。2.2 浸膏得率的测定精密移取太行菊提取液15mL，置于枯燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105枯燥至恒重，取出，置枯燥器中放置30min后称定重量。2.3 工艺优选
9、2.3.1 提取方法称取假设干份太行菊粉6g，分别用乙醇溶液在恒温水浴中加热浸泡，收集滤液。旋转蒸发仪减压蒸馏回收溶剂，得浓缩液，即提取的浸膏。膏液置烘箱内低温烘干，分别加60%(VV)乙醇置水浴上溶解，过滤，洗涤至100 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加30%(VV)乙醇定容至刻度，摇匀为供试溶液。2.3.2 因素水平设以乙醇为溶媒，根据预试结果设计正交试验，对提取工艺进行优化，见表1表1 因素水平设计水平 A B C D 溶媒浓度 溶媒量/倍 提取时间/h 提取次数1 50% 15 1 12 70% 20 1.5 23 90% 25 2 32.3.3 正
10、交试验称取太行菊8份，每份6g，按L9(34)正交表的条件分别进行提取，过滤，合并滤液，适当浓缩或稀释，定容至100mL，离心，取上清液分别测定总黄酮含量和浸膏得率3 结果与分析3.1 标准曲线的制定通过NaNO2A1(NO3)3 NaOH显色反响，在波长510nm处测定吸光度值如表2，以OD值对标准溶液浓度得出标准曲线如图1，用最小乘方回归法得直线方程：A=8.5049x-0.0435 R2=0.9994 (吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标)。总黄酮含量以芦丁计，在范围内与吸光度呈直线关系。标准样品的检测结果，见表2。黄酮含量的标准曲线图，见图1。 表2 标准样品的检测结果样品浓度 测定
11、1 测定2 测定3 平均值g/L0.0204 0.122 0.122 0.123 0.1220.0408 0.309 0.309 0.309 0.3090.0612 0.485 0.483 0.482 0.4830.0816 0.654 0.653 0.657 0.6540.102 0.816 0.816 0.819 0.81700.10.20.30.40.50.60.70.80.900.020.040.060.080.10.12浓度g/LOD值图1 紫外分光光度计测定总黄酮含量的标准曲线图3.2 试验结果3.2.1 结果记录将太行菊的浸膏重量，浸膏得率，总黄酮的含量记录，并制成图表，见表3。
12、其中浸膏得率=浸膏重量样品重量100；总黄酮含量=总黄酮重量样品重量100； 表3 太行菊提取工艺正交试验设计表及结果编 号 因素 测定结果A B C D 浸膏重量g 浸膏得率(%) 总黄酮含量% 1 1 1 1 1 0.32 5.34 1.98 2 1 2 2 2 0.51 8.46 2.15 3 1 3 3 3 0.59 9.87 2.50 4 2 1 2 3 0.58 9.62 2.98 5 2 2 3 1 0.38 6.39 2.32 6 2 3 1 2 0.48 8.0 2.65 7 3 1 3 2 0.50 8.34 2.23 8 3 2 1 3 0.52 8.66 2.45 9 3 3 2 1 0.39 6.45 2.21 直观分析法处理试验结果用直观分析法进行数据处理.以表示第j个指标下的第i个测定值。i=1，2n;j =1，2k.首
