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1、第 6 章 CpLTP3 、 CpLTPI.4 基因启动子克隆及瞬时表达分析为了深入探索蜡梅 nsLTPs 基因家族 4 个成员 CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3 、 CpLTP4 在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以 便寻找调控方面的差异。我们利用 hiTAIL-PCR 法分离得到了 CpLTP3、CpLTP4 基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启 动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。6.1 实验材料6.1.1 植物材料供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内 ,常规管理。蜡梅 小苗通过种子繁殖培育，种
2、子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度 85%, 16h 光照（2000Lx），温度 25C, 8h 黑暗，温度 20C。烟草 W38 （Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本实验室保存扩繁。6.1.2 菌种和载体大肠杆菌（Esherichia coli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，用于农杆菌介导的烟草 遗传转化，由本实验室保存。克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完 整的GUS基因表达元件，用于构建瞬时
3、表达载体。6.1.3 主要试剂Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4 DNA连接酶等购自 TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司； PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素（Ampicillin,Amp） 和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均购自上海生物工程有限公司。6.1.4 主要设备紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI），台式冷冻离心机 （Eppendoff），TGL-16B 型台式离心机（上海安亭），Eppendorf PCR 仪，IKA 型 涡旋器（德国产
4、），高压灭菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳 仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂）， FR-1 型凝胶成像系统（上海 复日）， 722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，水浴锅。6.1.5 常用溶液配方氨苄青霉素（Amp）：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL,-20C避光保存。 卡那霉素（Km）：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL,- 20C避光保存。TE（pH8.0）： 10mmol/L Tris-Cl（pH8.0）， 1mmol/L EDTA（pH8.0）。 50xTAE（电泳缓冲液）,1L： Tris 242g/L,冰醋酸 57.1
5、ml, EDTA（0.5mol/L pH 8.0）100ml/L 。6x琼脂糖凝胶上样缓冲液：溴酚蓝0.25% （W/V）,蔗糖40% （W/V）。6.1.6 基本培养基配方1）LB 培养基（培养大肠杆菌用）参照 3.1.52）YEB 培养基（培养农杆菌用）TrptoneYeast extractMgSO47H2O 蔗糖pH1% ( W/V)0.1%(W/V)0.5g/L0.5%( W/V)7.0（固体培养基加1.5%的琼脂）3）烟草转化基本培养基MS0： MS基本成分+蔗糖30g/L, pH5.8MS1（高盐胁迫培养基）：MS0+1mol L-1 NaCl； pH5.8MS2（干旱胁迫培养基
6、）：MS0+25%的PEG6000, pH5.8 MS3（脱落酸胁迫培养基）：MS0+100mMABA, pH5.8 MS4（赤霉素胁迫培养基）：MS0+100mMGA3 每种处理3瓶，重复3 次(5) GUS染液1) 0.5M MES(pH5.6)9.76g MES(吗啡啉乙磺酸钠)溶解于100ml MQ-water中，调pH5.62) 固定液(0.3%甲醛，10mM MES pH5.6,0.3M 甘露醇)3) 750ul 甲醛，2ul 0.5MMES,5.46g 甘露醇，加水至 100ml4) 50mM NaPO4 Buffer(pH7.0)57.7ml 1M Na2HPO4,42.3ml
7、 1M NaH2PO4,加水稀释至 2000ml5)组织化学染色试剂 X-Gluc将10g X-Gluc溶解于lOOul的二甲基甲酰胺中，加50mM NaP04(pH7.0)至 10ml6) 70%的乙醇。6.2 实验方法及操作过程6.2.1蜡梅基因组DNA的提取、纯化蜡梅DNA的提取、纯化见3226.2.2 hiTAIL-PCR法扩增启动子序列(1) 引物设计用Liu等人改良的TAIL-PCR: hiTAIL-PCR法扩增蜡梅非特异性脂转移蛋白基 因的启动子I280】。以已克隆到的腊梅CPLTP3和CPLTP4基因5端序列为基础，分别 设计3条特异的巢式引物RB0,RB1,RB2,结合简并引
8、物LAD、及AC0/AC1,分别进 行三轮扩增。LAD1: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3LAD2: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3LAD3: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAC-3LAD4: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCCAA-3LAD5: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3AC0: 5 -GGACGATGGACTCCAG-3AC1: 5 -ACGATGGACTCCAGAG-3
9、CPLTP3RB0: 5 - GACGCTACCTGCCCACACGTGATTG -3 CPLTP3RB1:5 -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCACGTGAGGAGAGGCCAACAGCAA -3CPLTP3RB2:5 -CAGCATCAGGCACACAACAACTCCG -3 CPLTP4RB0: 5 - CCGGTTCTACTTGTTGAATGGGTGG -3 CPLTP4RB1:5 -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACATGCTGCACCGGCACAGGCGC -3CPLTP4RB2: 5 -CAGAGTGTTGCGTCGGTGCCATTGC-3(2) h
10、iTAIL-PCR 过程以50ng的蜡梅基因组DNA为模板，用3个特异性的巢式引物和简并引物LAD1-5,AC0, AC1为引物对，进行TAIL-PCR扩增。将预扩增的PCR产物稀释50被作为第一轮PCR扩增的模板，第一轮PCR。各轮PCR反应体系及反应条件见表6-1。表6-1 TAIL-PCR的扩增体系、反应条件Table 6-1 Amplif ication condition for TAIL -PCR反应循环体系温度条件（时间）循环数ReactionCycling system /LTemperature condition ( Time)Cycle No.10x Ex-Taq Buf
11、fer293 C (2min) , 95 C(1min)125mM MgCl21.694 C (30s) , 60 C (1 min) 72C(1min)10预扩增2.5 mM dNTP1.694C (30s) , 25C (2min) , 72C (3min)1Pre-amplification20pMLAD194C (20s) , 48C (1min) , 72C(3min)256pMAC0172C (5min)16pMRB01genomic DNA1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.1ddH2O up to20第一轮扩增10x Ex-Taq Buffer2.5Primary r
12、eaction25mM MgCl2294C (20s) , 65C (1min) , 72C(2min)12.5 mM dNTP294C (20s) , 68C (1min) , 72C(3min)6pM AC1194C (20s) , 68C (1min) , 72C(3min)6pM RB1194C (20s) , 50C (1min) , 72C(3min)1350x1st PCR product172C (5min)1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.2ddH2Oup to25第二轮扩增10x Ex-Taq Buffer2.5Secondary reaction25mM Mg
13、Cl2294C (20s) , 68C (1min) , 72C(3min)2.5 mM dNTP294C (20s) , 68C (1 min) , 72C (3min)6pM AC1194C (20 s) , 50C (1 min) , 72C (3min)76pM RB1172C (5min)110x2st PCR product1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.2ddH2Oup to25用1琼脂糖胶电泳。预扩增产物通常为涂抹状，在检查少数样品后，不必对 所有预扩增产物电泳检测。同一样品的第一轮和第二轮产物在相邻的泳道电泳， 特异产物产生相应的大小差异。将获得的PCR产物连接
14、转化后送上海生工测序。6.2.3 CpLTP3pro, CpLTP4pro启动子片段的获得根据CpLTP3pro , CpLTP4pro启动子序列，设计含有HindiII和BamHI酶切位点 的扩增引物：FCpLTP3pro: 5 - AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3 RCpLTP3pro: 5 -GGATCCCTCCGCTTACTTACTCAGTCACACT-3 FCpLTP4pro： 5 - AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3 z RCpLTP4pro： 5 z -GGATCCTTGATGGATTTCACAGAGAATTG-3 z 以蜡梅基因组DNA为模板进行PCR扩增，25 m 1体系：1OxExTaq Buffer2.5 pLMgC121.5pLdNTP1.0pLDNA1.0pLFCpLTPpr o引物1.0pLRCpLTPpr o引物1.0pLEx Taq DNA聚合酶0.5pL (1U)ddH2O16.5pLTotal25.0pLPCR扩增条件为：95C预变性5min； 95C变性45s, 60C退火45s, 72C延伸 lmin, 30个循环；72C延伸1 Omin。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。6.2.4 克隆载体 pMD- CpLTP3pro 和 pMD- CpLTP4pro 的构建对P
