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1、酶动力参数 Km、Vmax和Kcat值的计算(以日立 U3010为例)强玮 2014-3-31一、Km根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程(Michaelis-Menten equation ): V =(VmaxS)/(Km + S)当v=0.5Vmax时，Km=S，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax 半时的底-610-2mol/L之间，单位一般为 mM或者uM。Km只与酶的性质有物浓度。Km值一般在10 关，而与酶的浓度无关。由于Km值与酶的浓度无关，所以计算时无需对蛋白进行定量，理论上诱导破碎的菌体上清(粗酶液)即可用来测酶活计算。具体计算方法以前常用双倒数法，但是这种算法现在
2、 稍微好一点的SCI杂志都不认可了，相对来说现在更准确和更常用的计算方法是直接对不同浓度的底物测得的酶活数据用米氏方程(Michaelis-Menten equation V =(VmaxS)/(Km + S)进行非线性回归(nonlinear regression)，拟合的方程中就给出了计算出的Km值。非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽量多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域，以下图为例，酶反应速度遵循米氏方程的规律，先是一级反应，速度随底物浓度上升也直线上升，然后是混合级反应， 趋于平缓，最后进入零级反应，反应速度不再随浓度上升而上升，而是趋于一个稳定
3、的值。 根据这个规律，具体梯度测试时，底物浓度的选点很重要， 要根据实时测得的斜率或活度值实时调整,尽量要覆盖这三个区域，这样回归拟合出来的米氏方程才是准确的，:算出的酶动力参数才是正确的。初速度Hill Fit of初速度0.30.10.002040底物浓度(mM)用于非线性回归分析的软件很多，Origin 8.0我比较喜欢，将酶活数据输入后，全选，“Analysis ”菜单下选择“ Fitting ”，进一步选择“ Nonlinear curve fit ”进入对话框，在函数 归类框“ Category”中选址“ Growth/Sigmoidal ”类函数，接着在子函数框“ Functio
4、n”中选 择“Hill ”函数。由于 Origin 8.0中没有保存米氏函数，但是Hill函数与米氏函数类似(如下)(“Origin Basic Functions”函数下的 Hyperbl也是类似与米氏函数的可选函数)，当n=1是就完全变成了米氏函数，所以接着在左边的“ Parameters”中将n=1的可选框构上，点击“Fit”进行拟合，Km、Vmax值等拟合的数据就在弹出的窗口中显示出来了，注意这里的Vmax值不是本文所指的 Vmax值，两者的意义和单位都不一样，发表用的Vmax单位通常为nkat mg-1 protein (见下文)，而此处的Vmax为输入数据时的 Y轴值，如果数据由日
5、立 U3010 分光光度计测得，则其代表“活度”，即每分钟内吸光度变化的量。nX Hill 函数： Y=Vmaxn nK + X二、VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。通常发表论文的Vmax单位为nkat xng-1 protein,表示每毫克纯化的蛋白有多少个 nkat 活力。这里有必要弄清楚酶活力单位的意义，国际上有两种活力单位：IU 和 Kat它们的意义分别为：1IU :指在特定条件(25C，其它为最适条件)下，在 1分钟内能转化1微摩尔底物的 酶量,或是转化底物中 1 微摩尔的有关基团的酶量。1Kat :在最适条件下，1秒钟能
6、使1摩尔底物转化的酶量。Kat和IU的换算关系：1 Kat=6 x 107IU，1IU=16.67n Kat日立 U3010 测得的酶活力是用“活度”表示的，即每分钟内吸光度变化的量。所以要 将活度换算为Kat，首先必须将吸光度的变化与底物的变化联系起来。这里的底物是指具有 特定波长的光吸收，用来指示酶反应进程的物种，如氧化还原酶通常选择NADH/NADPH 。这里以托品酮还原酶 TRI为例，测定340nm处NADPH的活度值。首先吸光度 Abs与底物 浓度 c 是有公式联系的：Abs=c l在实际测定中，“* 1 ”部分可以作为一个常数处理，在一个反应体系中将NADPH的浓度固定，测出吸光度
7、 A值后即可换算出“sl”值，通常选3个浓度，取三个“sl” 的品均值。如 TRI 的酶活测定中：200 uM 8 1=1.34 28 1=0.00671100 uM 8 l=0.7218 l=0.00721平均 8 l=0.00696由于活度的意义是 1nin 内吸光度的变化量，则选取一个线性比较好的酶反应的动态吸 光度曲线，记录下它 0s和60s两个点的吸光度值，用上面得到的8l值算出各自的底物浓度，其差值对应的就是该活度下的底物变化量。如一反应：活度=0.1182/min0s Abs=1.221 c(NADPH)=175.4 uM60s Abs=1.103 c(NADPH)=158.5
8、uM由 于 反 应 体 系 是 1nl, 则 变 化 量 为 c(NADPH)=175.4-158.5=17nM， 所 以 活 度/min对应17 nM的NADPH变化量，即每分钟，0.1182个活度表示有 17 nM的NADPH0.4发生了转化。为便于计算，换算为：活度 /min =14.38 nM/min (NADPH)0.3这样 ，吸光度的变化与底物的变化联系起来就联系起来了，用酶活力单位IU 的定义来换算，很容易就得出：0.1 活 度/min =0.01438 IU=0.24 nKat将上面非线性回归得到的Vmax (活度)值按上面的公式换算就得到了nKat值，进一步-1 protei
9、n)的值。除以每管反应蛋白的量( mg),就得出了标准 Vmax ( nkatxmg以木本曼陀罗 TRI 3 号重组蛋白为例，其对托品酮酶活拟合的结果是Km=2.65mM ,Vmax=0.48879/min( 活度)，每管反应酶量为 13.285ug, 则其-1Vmax=4.8879 x0.24/0.013285=88.3 nkat mg xprotein三、 KcatKcat 是酶的催化常数，定义为在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物 分子数，表示酶催化特定底物的能力。其单位一般是 s-1，即每秒钟内一个酶分子或酶活性 中心能催化多少个底物发生反应。还是以托品酮还原酶 TRI 催
10、化托品酮和 NADPH 的为例，其反应方程式如下：托品酮+ NADPH托品 + NADP物的转化量度关系上式0.1活度/min =14.38 nM/min (NADPH)已经提供了，我们只需对反应中的蛋白定量就行了。还是以上面的例子计算，非线性回归拟合出的Vmax=0.48879/min( 活度) ，对应的底物(NADPH )转化量是企 c(NADPH)=4.8879x 14.38=70.29 nM/min。每管反应酶量为 13.285ug, 重组酶蛋白的分子质量为 33245.88 道尔顿(这里的重组酶分子质量一定要加上前面融合的 标签序列，这里是 His 标签)，则酶分子数为 13285/
11、33245.88=0.40nM , 每秒钟每个酶分子催 化的底物分子数即 Kcat=70.29/(0.40 60)=2.93 s注意：上面的计算默认了每个酶分子都作为一个活性中心参与了催化反应，而没有顾及其是否以二聚体或多聚体的形式。 事实上， 有些酶是只以多聚体形式才有活性的， 这时就要 准确弄清楚是几聚体，然后将相应的 Kcat 值除以该值才是准确的。四、 Kcat/ KmKcat/Km 用来衡量酶的催化效率。 这一表示式又被称为特异性常数， 其包含了催化反应 中所有步骤的反应常数。 由于特异性常数同时反映了酶对底物的亲和力和催化能力， 因此可以用于比较不同酶对于特定底物的 催化效率或同一种酶对于不同底物的催化效率。其算法很简单，用 Kcat 值除以 Km 值即可，单位一般为-1-1或S-1 xmM -1，注意两者是1000倍sxM的关系，如上例，其Kcat/Km=2.93/3.65=1.11 s-1 xmM-1=1110s-1 xM-1o
