维生素 B2检验操作规程

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1、文件编码S0P-QC-2007-01共8页题目维生素B2检验操作规程制定制定日期审核审核日期批准批准日期颁发部门GMP办公室颁发日期执行部门质里部执行日期取代共印4份分发部门质量部、生产部、物流部1 感官要求取 10g 被测样品，置于洁净的白瓷盘中，用肉眼在自然光线下观察其色泽、 组织形态、杂质，品尝其滋味，嗅其气味。2 一般规定本标准所用试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和 GB/T 66822008 中规定的三级水。未指明的溶液为水溶液。试验中所用标准滴定溶液和其他所需溶液，在未注明其他要求时，均按 GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603 之规定制备。3 鉴别

2、试验3.1 荧光试验3.1.1 方法原理维生素B2 （核黄素）具芳香环和杂环，有长共轭结构的n -n *跃迁，具 有荧光性，在酸、碱性条件下及加入各种还原剂均会使维生素B2 （核黄素）转 变为无荧光的物质。3.1.2 试剂和材料3.1.2.1 盐酸溶液：1+2。3.1.2.2 氢氧化钠溶液：40 g/L。3.1.2.3 连二亚硫酸钠。3.1.3 分析步骤取约 1 mg 实验室样品，加 100 mL 水溶解后，溶液在透射光下显淡黄绿色 并有强烈的黄绿色荧 光；分成二份：一份中加盐酸溶液或氢氧化钠溶液，荧光即消失；另一份中加连 亚硫酸钠少许，摇匀后，黄色即消褪，荧光亦消失。3.2 紫外-可见吸收光

3、谱鉴别3.2.1 方法原理维生素B2 （核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，其紫外-可见吸收光 谱中有三个吸收峰（444 nm，375 nm 与 267 nm），用 A444nm/A267nm 及 A375nm /A267nm的比值来鉴别维生素B2 （核黄素）。3.2.2 试剂和材料3.2.2.1 冰乙酸。3.2.2.2 乙酸钠溶液：14 g/L。3.2.2.3 实验室样品溶液：避光操作。取约 0.075g 实验室样品，精确至 0.001 g,置烧杯中，加1 mL冰乙酸与75 mL水，加热溶解后，加水稀释，冷却至室 温，移置 500 mL 棕色容量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀；精密量取 10

4、mL， 置 100 mL 棕色容量瓶中，加 7 mL 乙酸钠溶液，并用水稀释至刻度，摇匀。3.2.3 仪器和设备3.2.3.1 紫外-可见分光光度仪。3.2.3.2 石英池（ 1cm）。3.2.4 分析步骤取实验室样品溶液扫描，在波长 444 nm1 nm、375 nm1 nm 与 267 nm 1 nm处有最大吸收，并测定吸光度（A），计算A375nm/A267nm的比值为0.31 0.33 和 A444nm/A267nm 的比值为 0.360.39。3.3 红外光吸收图谱鉴别3.3.1试剂和材料溴化钾：光谱纯，干燥品。3.3.2分析步骤在红外灯下进行，以防止吸潮。将实验室样品和溴化钾粉末置

5、入玛瑙乳钵中研匀，装入压片模具制备样片并 进行扫描。本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（附录B） 致。4 维生素 B2 的测定4.1 方法原理维生素B2 （核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，在波长444 nm处有 最大吸收，将样品溶 1%液于该波长处测定吸光度，以百分吸光系数（ E1cm ） 计算即得其质量分数。4.2 试剂和材料4.2.1 冰乙酸。4.2.2 乙酸钠溶液：14 g/L。4.3仪器和设备同 3.2.3。4.3 分析步骤取实验室样品溶液（ 3.2.2.3），在波长 444 nm 1nm 处，以水为空白对 照，测定吸光度（ A）。4.4 结果计算维生素B2 （核黄素）的质量分数w

6、l,数值以%表示，按公式（A.1）计算：x100%5000 x A323 x m x (1 - w2) x 100式中：5000实验室样品稀释体积，单位为毫升（ mL）；323维生素B 2 （核黄素）的百分吸光系数（Elcm）；A实验室样品溶液（A.3.2.2.3）的吸光度数值；m实验室样品质量的数值，单位为克（g）；w2 A.7 测得的干燥减量的数值， %。 两次平行测定结果的绝对差值不大于1.5%。5 比旋光度的测定5.1 方法原理维生素B2 （核黄素）的核糖醇侧链2,3,4-位有三个不对称碳原子，具有旋光活 性，在碱性条件下，呈左旋光性，以此检查样品的比旋度。5.2 试剂和材料5.2.1

7、 二硝基苯肼试液：取1.5 g 2,4-二硝基苯肼，加20 mL 硫酸溶液（ 1+1） 溶解后，加水使成100 mL,过滤。5.2.2无醛乙醇：取2.5 g乙酸铅，置具塞锥形瓶中，加5 mL水溶解后，加1000 mL乙醇，摇匀，缓缓加25 mL乙醇制氢氧化钾溶液（1-5），放置lh,强力 振摇后，静置12h，倾取上清液，蒸馏即得。检查：取 25 mL 无醛乙醇，置锥形瓶中，加 75 mL 二硝基苯肼试液，置水浴上 加热回流24h，蒸去乙醇，加200 mL硫酸溶液（2-100），放置24h后，应无 结晶析出。5.2.3 盐酸标准滴定溶液： c（ HCl） =0.1 mol/L。5.2.4 无碳酸

8、盐氢氧化钾溶液：取 20g 氢氧化钾，加 100mL 无醛乙醇，放置过 夜后，吸取上清液，加无醛乙醇稀释成 0.1 mol/L 的溶液，用 0.1 mol/L 盐酸 标准滴定溶液标定后，再精密量取18 mL，加新沸过的冷水至100 mL，摇匀。5.2.5实验室样品溶液：称取约0.25 g实验室样品，精确至0.000 1 g，加无 碳酸盐氢氧化钾溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含维生素B2 （核黄素）5 mg 的溶液，摇匀。5.3 仪器和设备5.3.1 旋光仪。5.3.2 旋光测定管。5.4 分析步骤取实验室样品溶液，按 GB/T 613 测定。5.5 结果计算维生素B2 （核黄素）的比旋光

9、度a m （20C，D）按公式计算：na m（20C,D）= 一ipa式中：a 测得的旋光角,单位为度（）；l 旋光管的长度，单位为分米（dm）；p a 溶液中有效组分的质量浓度，单位为克每毫升（g/mL）。6 感光黄素的测定6.1 方法提要维生素B2 （核黄素）几乎不溶于三氯甲烷，杂质感光黄素溶于三氯甲烷，在 440 nm处有紫外吸收，因此用三氯甲烷提取感光黄素，排除维生素B2（核黄素） 的干扰后，在此波长处测定，作限量检查。但维生素B2 （核黄素）在乙醇中稍 有溶解，为克服测定时的干扰，所以必须使用无醇三氯甲烷。6.2 试剂和材料6.2.1 无水硫酸钠。6.2.2无醇三氯甲烷：取500 m

10、L三氯甲烷，用水洗涤3次，每次50 mL,分取 三氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥12h以上，用脱脂棉过滤，蒸馏，即得。临用前 配制。6.3 仪器和设备6.3.1 紫外-可见分光光度仪。6.3.2 石英池（ 1 cm）。6.4 分析步骤6.4.1实验室样品溶液的制备：称取约0.025 g实验室样品，精确至0.000 1 g， 加10 mL无醇三氯甲烷，振摇5min，过滤。6.4.2测定取实验室样品溶液，在波长440 nm处，以无醇三氯甲烷为空白，测定吸光度（A）。7 干燥减量的测定7.1 仪器和设备7.1.1 扁形称量瓶。7.1.2 恒温干燥箱。7.2 分析步骤称取约0.5 g实验室样品，精确至0.

11、000 1 g，置于105 C2 C干燥至 恒重的扁形称量瓶中，厚度不可超过5 mm，105 C2 C干燥至恒重。7.3结果计算维生素B2 （核黄素）干燥减量的质量分数w2，数值以%表示，按公式（A.3） 计算：ml m 2x 10%式中：Ml干燥前实验室样品和称量瓶的总质量数值，单位为克（g）；m2干燥后实验室样品和称量瓶的总质量数值，单位为克（g）；m实验室样品的质量数值，单位为克（g）。取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于 0.05%。8 灼烧残渣的测定8.1 方法原理 样品加硫酸经灼烧后所留的硫酸盐，用重量法测定。8.2 试剂和材料 硫酸。8.3 仪器

12、和设备8.3.1 瓷坩埚。8.3.2 高温炉。8.4 分析步骤称取约1.0 g实验室样品，精确至0.000 1 g,置于已在550 C50 C 灼烧至恒重的瓷坩埚中，用小火缓缓加热至完全炭化，冷却至室温后，加 l mL 硫酸使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，移入高温炉中，在550 C50 C灼 烧至恒重。8.5 结果计算维生素B2 （核黄素）灼烧残渣的质量分数w3，数值以%表示，按公式计算:m3 一 m4x100%式中：m3 残渣和坩埚的总质量数值，单位为克（g）；m4坩埚的质量数值， 单位为克（ g）；实验室样品的质量数值, 单位为克（ g）。取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测

13、定结果的绝对差值不大于 0.02%。9 重金属的测定9.1 方法原理样品中杂质金属在酸性（PH3.5）条件下，与硫化氢或硫化钠试液显色。样品与标准铅溶液同法测定，以此检查其限度。9.2 试剂和材料9.2.1 硝酸。9.2.2 硫酸。9.2.3 盐酸。9.2.4 甘油。9.2.5 乙酸铵。9.2.6 硝酸铅。9.2.7 硫代乙酰胺。9.2.8 氨试液：400-1000。9.2.9 氢氧化钠溶液： c（ NaOH） =1 mol/L。9.2.10 盐酸溶液： c（HCl） =2 mol/L。9.2.11 盐酸溶液： c（HCl） =7 mol/L。9.2.12 氨水溶液：c （NH3 H2O） =

14、5 mol/L。9.2.13 酚酞指示液： 10g/L 乙醇溶液。9.2.14乙酸盐缓冲液（pH3.5）:取25 g乙酸铵，加水25 mL溶解后，加38 mL 7 mol/L盐酸溶液，用2 mol/L盐酸溶液或氨水溶液准确调节pH至3.5 （pH计）， 用水稀释至100 mL，即得。9.2.15硫代乙酰胺试液：取约4g硫代乙酰胺，精确至0.01 g，加水使溶解成 100 mL,置冰箱中保存。临用前取5.0 mL混合液（由1 mol/L 15 mL氢氧化钠 溶液、5.0 mL水及20 mL甘油组成），加上述1.0 mL硫代乙酰胺溶液，置水浴 上加热20s，冷却，立即使用。9.2.16铅标准溶液：

15、称取约0.160 g硝酸铅，精确至0.000 2g,置于1000 mL 容量瓶中，加5 mL硝酸与50 mL水溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备 液。临用前，移取10 mL0.02 mL贮备液，置于100 mL容量瓶中，加水稀释 至刻度，摇匀，即得（每1mL相当于10 p g的Pb）。配置与贮存用的玻璃仪器 均不得含铅。9.3分析步骤按中华人民共和国药典2005年版二部附录VIII H重金属检查法第 二法测定，具体方法如下：取A.8中遗留的残渣，加0.5 mL硝酸，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后（或取1.0 g实验室样品，缓缓灼烧至完全炭化，冷却至室温，加0.5mL1.0mL硫酸，使 恰湿润，用低温加热至硫酸除尽后，加0.5 mL硝酸，蒸干，至氧化氮蒸气除尽 后，冷却至室温，在500600C灼烧至完全