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1、MCPIP 1蛋白质结构、功能的研究进展摘要ZC3H12A是免疫系统中的一个重要基因，其编码的蛋白质ZC3H12A/MCPIP 1在免疫相关疾病，尤其是自身免疫病和炎症反应中发挥重要的抑制效应。ZC3H12A的表达能够被多种炎症相关细胞因子所诱导。近来的研究报道，MCPIP 1具有转录因子、RNA酶、去泛素化酶等作用，其在调控基因转录、mRNA降解、多聚泛素链的去除、细胞凋亡、细胞自噬、炎症抑制、细胞分化、血管生成等方面都有重要作用。基因敲除小鼠患有严重的高免疫球蛋白血症、淋巴结肿大、浆细胞和记忆细胞的积聚及自身抗体的大量产生等免疫功能紊乱疾病。本文较为系统地阐述了ZC3H12A基因的克隆、M
2、CPIP 1蛋白的结构及功能，从时间的维度观其主要研究历程，以及对免疫系统的重要影响。大体上浅析了MCPIP 1从其发现至今的探索情况。【关键词】 ZC3H12A Zc3h12a MCPIP 1 RNA酶 凋亡 去泛素化酶1 简介ZC3H12A/MCPIP是一种锌指蛋白。它的全名是具有CCCH锌指结构域的蛋白质12A（Zinc finger CCCH domain-containing protein 12A），简称ZC3H12A1，又称MCP-1诱导蛋白（MCP1-induced protein，MCPIP 1）2。MPCIP的编码基因是ZC3H12A，它属于ZC3H12基因家族，该家族中共
3、有4个成员，分别编号为ZC3H12A、ZC3H12B、ZC3H12C、ZC3H12D1。此家族保守性很强，在很多物种（包括果蝇、秀丽线虫、小鼠和大鼠等）中都有发现其同源序列1。MCPIP 1最初被发现于经MCP-1处理的人外周血单核细胞中2，而后又在经IL-1刺激的人单核细胞来源的巨噬细胞中被发现3。在TNF、MCP-1、IL-1或LPS等细胞因子的作用下，该基因的转录水平被显著激活1, 2, 3, 4, 5, 6。同时，具有CCCH锌指结构的蛋白质在巨噬细胞相关的器官（如胸腺、脾脏、肺、小肠和脂肪组织等）中表达水平很高6。对于Zc3h12a基因敲除小鼠的表型分析表明4, 7，该基因的缺陷与自
4、身免疫疾病的发生相关，在炎症相关的生理和病理过程中具有重要意义。 克隆发现该基因的发现单核细胞趋化蛋白质1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，它能够招募并激活单核/巨噬细胞，是使单核/巨噬细胞迁移的主要趋化因子。MCP-1与靶细胞膜上的CCR2结合，启动了一系列的信号通路，导致单核/巨噬细胞向MCP1高浓度处趋化性迁移8，9。用MCP-1刺激人外周血单核细胞后，提取细胞内的总mRNA。将测序结果与基因注释数据库中的数据进行序列比对后发现了一些未被注释的基因。其中表达差异最显著的一个基因是目前未知功能的基因，在EST数据库中查找到了与之相对应的序
5、列，同时在GeneBank数据库中查找到了对应的人cDNA克隆。（GeneBank序列号AW206332）研究者将它命名为人MCP1诱导蛋白（MCP-induced protein， MCPIP 1）2。对蛋白质序列分析发现，MCPIP 1有599个氨基酸，分子质量约为65.8kD，有两个脯氨酸富集区，一个核定位序列，和一个CCCH锌指结构域2。而后发现其序列中还存在一个PIN结构域4和一个泛素结合结构域7。由于该蛋白质具有CCCH锌指结构域，因而被命名为具有CCCH锌指结构域的蛋白质12a（ZC3H12A）1。序列比对发现，人MCPIP 1与小鼠中的同源蛋白质的氨基酸组成有82%的相似度，c
6、DNA的核苷酸序列组成有80%的相似度2。该基因家族的发现将MCPIP1蛋白质序列输入GeneBank数据库，在人中查找到另外3个与之相似度很高的序列。研究者将它们归属于同一家族，分别命名为MCPIP1、MCPIP2、MCPIP3、MCPIP4，其相对应的基因分别被命名为ZC3H12A (位于染色体 1p34.3)、ZC3H12B(位于染色体Xq12)、ZC3H12C(位于染色体1q22.3)，以及ZC3H12D(位于染色体6q25.1)。这一家族的成员间的共同特点为，它们都含有一个CCCH型锌指结构。同时，在小鼠中也发现了这四个基因的同源基因1。基因与蛋白质概况基因定位通过对基因组序列比对分
7、析，ZC3H12A位于人染色体1p35.3-p33上，Zc3h12a位于小鼠4号染色体上。基因结构ZC3H12A的大小约为9860 bp，有6个外显子。第一个外显子是非编码序列，转录从第二个外显子开始。启动子位于该基因上游-7660bp，具有一个Elk-1结合位点和一个SRF结合位点10。增强子位于第二个内含子中，具有4个NF-kB结合位点5。该基因上有61个已被描述的SNP。在这些SNP中，11个是非同义的SNP，其中1个位于启动子中，2个位于第二个内含子上的增强子中。在这11个非同义SNP中，有2个是标签SNP。蛋白质结构ZC3H12A编码的蛋白质MCPIP 1有599个氨基酸，其分子质量
8、为65.8 kd。对MCPIP 1的序列分析表明，该蛋白质中含有CCCH锌指结构域（能够介导蛋白质与核酸的作用）、核定位序列、脯氨酸富集区（介导蛋白质与蛋白质的相互作用）、PIN结构域（具有RNA酶活性）、以及泛素结合结构域等。这些特征性序列模体为MCPIP 1功能的研究指明了方向。通过同源性分析，研究者在小鼠基因组中发现了与MCPIP 1同源的基因序列。在核苷酸水平上它们的相似度有80%,在蛋白质水平上它们的相似度有82%。通过序列比对分析发现，MCPIP家族在进化上有很高的保守性，在很多动物中（包括果蝇、秀丽线虫、小鼠、大鼠）都存在与该家族成员高度同源的cDNA序列1。CCCH锌指结构域C
9、CCH结构是锌指的一种类型，主要的作用是结合RNA6, 11, 12，调控mRNA的加工。哺乳动物有1%的基因编码锌指蛋白13。目前所知，共有至少14种锌指，CCHH型和CCCC型锌指较为常见，CCCH型锌指较少见，只占锌指蛋白的约0.8% 11, 12, 14。CCCH锌指结构由17到25个氨基酸组成。CCCH蛋白的特点是包含1到6个CCCH型（C-X415-C-X46-C-X3-H）锌指结构域，同时也富含甘氨酸和苯丙氨酸。CCCH锌指结构域十分保守，在植物、无脊椎动物、脊椎动物中都有发现。15锌指蛋白通常是DNA结合蛋白。锌指也能调节该蛋白与RNA、蛋白质、脂质的作用。CCCH锌指蛋白中的
10、大多数能与RNA结合，调控mRNA的加工，包括mRNA成熟、出核、修饰、降解11, 12。该类型的蛋白质在巨噬细胞相关的器官内表达量很高，如胸腺、脾脏、肺、小肠和脂肪组织等6。MCPIP 1的CCCH锌指结构是C(X)5C(X)5C(X)3H 型锌指结构，脯氨酸富集区Zc3h12a有2个脯氨酸富集区，分别位于第100126位氨基酸（脯氨酸占37%）和第458536位氨基酸（脯氨酸占28%）2。脯氨酸富集区通常调节蛋白质与蛋白质的相互作用，说明ZC3H12A可能通过此结构域，与其他蛋白质有相互作用。PIN结构域PIN结构域（PIN-like domain）位于ZC3H12A蛋白氨基酸序列的第13
11、0280位。多数具有该结构域的蛋白质都有RNA酶活性。在该结构域中有4个经典的保守的酸性氨基酸，分别是D141、E185、D226、D244，它们形成一个带负电的袋子状的空间结构，能够与Mg2+结合，从而发挥降解mRNA的作用4。该RNA酶结构域在Zc3h12家族4个成员间是保守的，并且在多种物种中都找到了其同源序列4。DUB结构域MCPIP1的去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）结构域位于N端，与去泛素化功能相关7。序列比对发现MCPIP1序列中不存在上述已知的任何一种DUB结构域。然而序列比对发现，该蛋白质N端具有一个泛素相关结构域（ubiquitin as
12、sociation domain，UBA）。该结构域在多种物种的MCPIP1蛋白质序列中保守7。实验发现，该结构域具有结合泛素的作用7。同时，通过序列分析发现，该蛋白质的N端具有一段在多种物种中都十分保守的区域（N-terminal conserved region，NCR）。该区域中含有1个半胱氨酸盒（Cys box）和1个天冬氨酸盒（Asp box）7，这两段保守序列在很多DUB中都存在。通过体外捷短实验发现，NCR具有去泛素化酶的活性，该段区域与一种DUB结构域UCH具有27%的序列相似度。MCPIP1的去泛素化酶活性与很多其它的去泛素化酶都有相似的特点。如含有两个保守的序列模体半胱氨酸
13、盒（Cys box）和天冬氨酸盒（Asp box）；作为半胱氨酸蛋白酶，MCPIP1的去泛素化酶活性会被一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂NEM完全抑制；其去泛素化酶活性并不依赖于Mg2+和ATP，但是Zn2+和Mn2+却会对该酶活性产生抑制作用。序列分析发现，MCPIP1中的去泛素化酶结构域与RNA酶结构域都位于NCR区域。Asp box中的D141、Cys box中的C157和锌指结构域中的C306是DUB活性的关键位点。D141也是RNA酶活性的关键位点。D141、C157、C306和D278/D279的突变会影响MCPIP1对NF-B信号通路的抑制活性。C157的突变也会导致MCPIP1对JNK
14、信号通路活性及LPS诱导的炎症细胞因子产物的抑制效应的丧失。这些结果都说明，MCPIP1对炎症信号通路的抑制效应与DUB活性息息相关7。蛋白质的亚细胞定位对MCP-1转基因小鼠的表型分析发现，MCPIP 1主要定位于心肌细胞的细胞核中2，而随后对小鼠巨噬细胞中MCPIP 1表达情况的研究表明MCPIP1定位于细胞质1, 4，而后对HepG2细胞的研究表明MCPIP1定位于细胞骨架及以颗粒的形式位于细胞质中3。基因的组织特异性表达情况Northern Blot分析表明，ZC3H12A基因的mRNA在白细胞中含量最高，其次是在心脏组织和胎盘，在脾脏、肾脏、肝脏和肺中稍低。在脑、胸腺、肌肉组织、小肠
15、和结肠中基本上没有其转录本的存在。据MCPIP1的mRNA在白细胞中的高含量推测其在免疫系统中具有重要作用3。基因敲除小鼠表型Zc3h12a敲除小鼠表现为生长迟缓，且大多数在12周内自发死亡。敲除小鼠患有严重的脾肿大和淋巴结肿大。肺部浆细胞浸润、胆管和胰腺的副上皮化（paraepithelium）。浆细胞在淋巴结和脾脏中大量聚积。在淋巴结内，肉芽肿的形成导致巨噬细胞融合形成巨细胞。Zc3h12a敲除小鼠患有严重的贫血，以及白细胞和血小板的升高。并患有高免疫球蛋白血症，肺间质组织中有浆细胞浸润，并产生大量的IgG和IgA。通过将基因敲除小鼠的骨髓转入经辐照的正常小鼠中，发现受体小鼠表现出延迟但显著的淋巴结肿大、浆细胞和记忆细胞的积聚。这说明是造血细胞导致小鼠免疫功能紊乱的发生。以上这些表型说明，Zc3h12a在防止以能分泌免疫球蛋白的浆细胞数量的增加及肉芽肿形成为标志的重症自身免疫性疾病的发展中发挥重要作用。基因敲除小鼠血浆中的TNF和MCP-1含量显著增加。无论是在正常培养条件下还是在LPS诱导条件下，骨髓来源的巨噬细胞分泌的促炎细胞因子的水平都有很大程度的提高，敲除小鼠自发地患有致死性的炎症综合症。其巨噬细胞和脾脏细胞中炎症相关基因的表达有显著提高，JNK和IB激酶的活性升高，TNF受体相关因子的多聚泛素化升高。基因敲除小鼠的炎症相关细胞因子的表达增强。骨髓来
