基因工程知识点

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1、基因工程1、操作水平：dna分子水平目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。理论基础： 1）物质基础脱氧核苷酸 2）结构基础规则的双螺旋结构 3）中心法则，共用一套遗传密码2、基因工程（genetic engineering）:指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。（基因操作、遗传工程、重组DNA技术）。1973年诞生的基本用途：分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至

2、 新物种。3、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体） 内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。其核心步 骤是DNA片段之间的体外连接。4、基因工程的基本形式：第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程第四代 基因组或染色体的转移 基因组工程5、基因工程诞生的理论基础：理论上的三大发现1】证实了 DNA是遗传物质；2】揭示了 DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理； 3】遗传

3、密码的破译和遗传信息传递方式的确定。6、DNA双螺旋：带负电的糖-磷酸骨架在外侧，碱基在螺旋中间相互堆叠，以5 一 3 方向反向平行关系。第二章 用于核酸操作的工具酶1、寄主的限制和修饰现象：【1】作用：保护自身DNA不受限制； 破坏入侵的外源DNA，使之降解。【2】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。因为它们在接受新宿 主甲基化酶修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。2、限制性核酸内切酶的命名：女口： Hindi属名（H） +种名（in） +株名（d） +类型（I）II型限制性核酸内切酶的基本特性：识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序

4、列，大部分酶的切割位点在识别序 列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。*一个单位的限制酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50l反应体系中,1h完全降解1昭底物DNA所需的酶量。 两种DNA甲基化酶：DNA腺嘌吟甲基化酶（dam），甲基化酶在5 GATC3 序列中的腺嘌吟N6位引入甲基.DNA胞嘧啶甲基化酶（dem），甲基化酶在5 CCAGG3 或 5 CCTGG3 序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基， 受其影响的酶有EeoR II等.*3、诱发星号活性产生的原因：高甘油含量5%；（2）内切酶用量过大；低离子强度；高pH；含有有机溶剂，如乙醇；2Mn/Cu/Zn等非Mg二价阳离子存

5、在。4、DNA聚合酶I的基本性质：5 一3 DNA聚合酶活性；5 一3 的核酸外切酶活性；3 一5 的核酸外切酶活性。 切口平移法：目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。Klenow酶的基本用途：1】补平由核酸内切酶产生的5粘性末端；2】DNA片段的同位素末端标记；3】cDNA第二链的合成；4】双脱氧末端终止法测定DNA序列Klenow片段：保留5一3聚合酶活性和3一5 外切酶活性；丧失了 5一3 的核酸外切酶活性。T4-DNA聚合酶的基本用途：1】切平由核酸内切酶产生的3粘性末端;2】DNA片段的同位素末端标记T4-DNA酶的基本特性：1】5一3的DNA聚合酶活性和3一5的核酸外切

6、酶活性；2】在无dNTP时，可以从任何3 -OH端外切；3】只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；4】在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位；5】外切酶活性比Klenow酶高1001000倍。 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶基本特性（用途）：1.以RNA为模板聚合cDNA链；2双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链S1核酸酶的基本反应（用途）：（来源于稻谷曲霉菌；催化反应需Zn2+和酸性条件pH4.04.5）1）内切单链DNA或RNA； 2）内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA; 3）在DNA上定位RNA Bal31核酸酶：单链内切、双链外切的核酸酶；运用于诱变育种。末端

7、脱氧核昔酰转移酶（TdT）基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 碱性磷酸酶：来自小牛胸腺的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）; 来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）。它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5磷酸变为5 -OH末端。第三章 基因工程载体1、载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。 *2、基因工程对载体的要求（理想质粒载体的必备条件）：（1）在宿主细胞内能独立复制 （2）有选择性标记 （3）分子量小，拷贝数多（4）有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体的复制（5）容易从宿主细胞中分离纯化载体的基本条件：能在宿主细胞内进行

8、独立和稳定的自我复制；具有合适的限制性核酸内切酶位点；具有合适 的选择性标记基因，用来筛选重组体DNA。3. 载体的种类：质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体、（柯斯质粒、动物病毒）特点：载体DNA是单个复制单元，在宿主细胞内应具有独立复制能力；含有多种限制行内切酶的单一切点； 分子量尽可能小，便于细胞中分离纯化，离体条件下操作；载体内有不影响其复制，生长的非必要区域； 具有多种选择性标记。*构建基因文库常用的载体：A载体系列、cosmid （柯斯质粒）载体、YAC （酵母人造染色体）、BAC （细菌人造染色体）、 P1 源人工载体第一节 质粒载体质粒：独立于染色体

9、以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中 组成部分：复制必需区、选择标记基因、限制性核酸内切酶位点（克隆位点）生物学特性：分子小、编码基因少、双链环状闭合。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）空间构型： 共价闭合环状DNA （SC）,呈超螺旋 开环DNA （OC）, 一条链上有一至数个缺口 线形 DNA（L 构型），呈负超螺旋*电泳速率：SC-DNA最快、L-DNA次之、OC-DNA最慢二、质粒的类型1、接合型质粒:能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）严紧型质粒；不符合基因工程的安全要

10、求2、非接合型质粒:不能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因（缺 乏转移所需的mob基因），因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如：R质粒（抗性质粒）、Col质粒（大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒）弛型质粒； 符合基因工程的安全要求三、质粒的复制类型-松弛型质粒:拷贝数多，有1060份拷贝严紧型质粒:拷贝数少，只有13份拷贝四、质粒载体的构建1. 天然质粒的局限性1）分子量大，拷贝数低：第一个用于基因克隆的天然质粒PSC101，分子长9.09kb，属严紧型质粒；但只有Tetr 个 选择

11、性标记；分子质量大，拷贝数低2）筛选标志不理想：ColEl质粒筛选标志是大肠杆菌素E1; colicin E1能杀死不含ColEl质粒的菌，形成“噬菌斑”。2. 质粒载体必须具备的基本条件2）具有若干个限制性内切酶的单一酶切位点4）具有复制起点（ORI）6）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达1）具有较小的分子量和较高的拷贝数3）具有两种以上的选择标记基因5）缺失 mob 基因3. 质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记抗性基因氨苄青霉素抗性（Ampr）青霉素的衍生物；通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌氯霉素抗性 （Cmlr）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并

12、阻止肽键的形成，杀死生长的细菌 四环素抗性 （Tetr）通过与30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。 链霉素抗性 （Strr）通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。卡那霉素抗性 （Kanr）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌4. 人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体：如ColE1、pMB1,适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体：如pSC101，不适合大量扩增DNA用；（3）失控的质粒载体：属温度敏感型复制控制质粒，如pBEU1、pBEU2（4）插入失活型质粒载体：载体的克

13、隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。（5）正选择的质粒载体：如pUR2、pTR262；直接选择转化后的细胞；目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体; 只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。（6）表达型质粒载体：主要用来使外源基因表达出蛋白质产物 第四章 分子基本操作技术*1、DNA的提取方法：最常用的是碱抽提法。原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双 链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。步骤：溶菌一一破膜，蛋白质和DNA变性一一中和（用NaAc） 一一离心除去

14、沉淀一一纯化DNA （酚-氯仿抽提）一一 沉淀 DNA2、 三种电泳的区别和适用范围【*电洗脱槽适用于回收大片段DNA】琼脂糖凝胶电泳：（水平）分离范围广，分辨率低 脉冲电场凝胶电泳：适用于超大分子量的DNA电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：（垂直）分辨力高，用于核酸，蛋白质分离，DNA序列分析3、核酸的分子杂交：1） Southern blot【用DNA （或RNA）探针检测DNA样品】2）Northern blot【用DNA （或RNA）探针检测RNA样品】3）原位杂交【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变，可以直接找出阳性菌落】第六章 目的基因的获取和基因文库构建第一节 基因组 DNA 片断化1、限制性内切

15、酶法：优点：由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也被切成碎片。2、随机片断化：（1）限制性内切酶局部消化法；（2）机械切割法：超声波、高速搅拌3、化学合成目的基因方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。化学合成DNA片断的组装方法：互补连接法、互补延伸连接法4、寡聚核苷酸化学合成的优点： 直接合成基因；合成引物（20mer左右）；合成探针序列；定点突变合成；合成人工接头或衔接物。5、目的基因的获取方法：核酸杂交法、差示杂交法、PCR筛选法、表达文库的免疫学筛选。第二节 基因文库构建1基因文库：是用分子克隆方法将某种生物或其组织细胞的所有DNA片段插入适当载体，转化适当宿主菌后进行保存 的克隆集合。2构建步骤：1】染色体DNA大片段的制备：物理切割法：超声波、机械搅拌；酶切法：局部消化。2】载体与基因组DNA大片段的连接：粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物加尾。构建步骤：克隆载体制备-大分子基因组DNA分离-插入片段制备-插入片段与载体连接-连