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1、-聚赖氨酸对铜绿假单胞菌的抑菌机理摘要；目前，在食品添加剂市场上使用的防腐剂种类很多，但大部分是人工合成防腐剂。因此类防腐剂受pH 影响，只有在酸性条件下才能发挥作用，如山梨酸及其钾盐，苯甲酸及其钠盐等，均属化学防腐剂，对人体有一定的毒副作用。而占比重很小的天然防腐剂又存在着抗菌谱窄、效率低、防腐作用不明显等弊端。因此，研发抗菌谱广、抗菌性强、安全无毒、受pH 影响小的天然食品防腐剂已经成为世界各国食品科技工作者的研究重点。1977年日本学者SShima和HSakai在从微生物中筛选DragendoPositive(简写为DP)物质的过程中，发现一株放线菌No346能产生大量而稳定的DP物质，
2、通过对酸水解产物的分析及结构分析，证实该DP物质是一种含有2530个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为-多聚赖氨酸(一 PL)。聚赖氨酸(-PL) 是一种由单个赖氨酸分子在-羟基和-氨基形成酰胺键而连接成的均聚氨基目前主要通过白色链霉菌( Streptomyces albulus) 的微生物合成进行生产。-聚赖氨酸具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH范围广等特点,因而在食品保鲜方面的应用越来越多。文中简单介绍了聚赖氨酸有关微生物合成的方法,重点介绍了-聚赖氨酸作为食品保鲜剂的抑菌特性及在食品等方面的应用前景。关键词：-聚赖氨酸, 微生物合成, 食品保鲜剂, 应用1 前言1977
3、 年,Shima 等从土壤中分离出了一种放线菌白色链霉菌( Streptomyces albulus ) 346 ,发现其培养液过滤后有一种对德拉根道夫(Dragendorff) 试验(用碘化铋钾试验生物碱形成特性加成化合物的结晶) 呈阳性的化合物,该物质经验证为一种由单一赖氨酸在-羟基和-氨基形成酰胺键而连接成的聚氨基酸,有2030 个赖氨酸单体,为-聚赖氨酸(以下简称-PL) 。-PL 具有很广的抗菌谱,对生长的细菌其最小抑菌浓度在100g/ mL 以下。-PL 能引起人们广泛的关注就在于可以作为食品保鲜剂,具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH 范围广等特点。以老鼠进行的
4、动物实验已证明,-PL 是一种安全的食品保鲜剂,在日本,采用Streptomyces al-bulus 进行工业发酵生产的-PL 已进入商业市场。本文简单介绍-PL 微生物合成的方法,重点介绍-PL 作为食品保鲜剂的抑菌特性及在食品等方面的应用前景。一、-聚赖氨酸的性质1、-聚赖氨酸的理化性质 1.1 化学结构由S.albulus 生产的- PL 由2535 个L-赖氨酸残基组成，除了长度以外，没有明确的研究结果表明- PL 有二级或者三级结构。1.2 最适pH 值-聚赖氨酸为淡黄色粉末、吸湿性强，略有苦味，最适pH 值为58。是赖氨酸的直链状聚合物。它不受pH值影响，对热稳定(120，20m
5、in)，能抑制耐热菌，故加入后可热处理。但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用。分子量在36004300之间的-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，-聚赖氨酸失去抑菌活性。1.3 热稳定性-PL 热稳定性非常好，即使将其水溶液加热至100 处理30 min 或120 处理20 min 后，也不会发生分解现象，仍保持原有聚合物的长度。J Hiraki（2000）研究表明，在pH 值3.0 时加热，- PL 的结构也未发生变化。- PL 能够承受一般食品加工过程中的加热处理，可以随原料一同进行
6、灭菌处理，防止二次污染。由于聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔点，250以上开始软化分解。一聚赖氨酸溶于水，微溶于乙醇。对其表征进行红外光谱分析表明：在16801640cm -1和15801520cm-1有强吸收峰。1.4 胶体性质-PL 作为一种浓缩胶质溶液的交联剂，它的效力对pH 值和胶质分布有依赖性。在胶质中，阳离子电荷与阴离子缩氨酸聚合物的平衡导致了胶体的不透明性和最终网络结构的崩溃1。在pH 值接近中性时，L-聚赖氨酸可以作为一种有效的胶质网络交联剂。一种甲基酯化程度为36%的胶质形成了一种透明的弹性凝胶体，胶质中的电荷重新分配。凝胶体的硬度随着交联剂的浓度增加而增加，在- PL 胶
7、质所占比率为0.210.56 时达到最大值。聚阳离子赖氨酸的添加会导致凝胶体透明度的下降，并且最终导致网状结构的崩溃。胶质聚赖氨酸链的亲和力随着聚赖氨酸链长的不断增长而增加，聚赖氨酸残基达到47 个时，交互作用的稳定性常数是8 700。作为一种交联剂，聚赖氨酸的存在降低了Donnan 效果的影响程度，导致了网状物的融胀。在复杂的非原质体环境中，离子影响着全部平衡，包括无机的和有机的阳离子，可以通过对网络交联和融胀的影响调整胶质网络的性质。2、-聚赖氨酸的生物学性质 -聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，这种生物防腐剂在80年代就首次应用于食品防腐。-聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体
8、必需的8种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此一聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂，其急性口服毒性为5g/kg。 -聚赖氨酸抑菌谱广，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等都有明显的抑制和杀灭作用.聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌，保加利亚乳杆菌，热链球菌，革兰氏阴性的大肠杆菌，沙门氏菌以及酵母菌的生长有明显抑制效果，聚赖氨酸与醋酸复合试剂对枯草芽胞杆菌有明显抑制作用。二、-聚赖氨酸的抑菌机理-聚赖氨酸的作用机理主要表现在如下3个方面
9、： (1)作用于细胞壁和细胞膜系统； (2)作用于遗传物质或遗传微粒结构； (3)作用于酶或功能蛋白。我们对聚赖氨酸的抑菌性能进行了研究，发现一PL不仅可抑制耐热性较强的G+的微球菌，而且对其它天然防腐剂(如Nisin)不易抑制的G-的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果亦非常好，同时还可抑制保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、酵母菌的生长。但是单独使用-PL时对枯草芽孢杆菌、黑曲霉抑制不明显，采用一PL与醋酸复合处理，对枯草芽孢杆菌抑制作用增强，经高温处理后的- PL对微球菌仍有抑菌活性。 J Hiraki 等指出，-PL 的抑菌机理可能是因为它是阳离子表面活性物质，能破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、
10、能量和信息传递中断，还能与细胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致细胞死亡。-PL 对细菌、真菌、酵母的最低抑制浓度不同，原因可能是它们的细胞表面结构不同。-PL 既可以抑制革兰氏阳性菌生长，又可以抑制革兰氏阴性菌生长，除了乳链球菌和空肠弯曲菌（150 g/mL）外，对其他细菌的最小抑制浓度均不超过50 g/mL。在对酵母的抑制作用中，对毕赤酵母、接合酵母的最小抑制浓度是150 g/mL,对假丝酵母、法夫酵母、子囊菌、乳糖分解酵素红酵母、掷孢酵母、啤酒酵母等其他酵母的抑制作用都不超过50 g/mL。而对霉菌的最小抑制浓度均超过50 g/mL2。S Shima 等采用Escherichi
11、a coli K-12 研究了-PL 的分子量与抑菌性关系的结果表明，超过9 个L-赖氨酸残基才可以抑制微生物的生长，而化学改性氨基会降低抑菌活性3。-PL 是一种阳离子聚合物，等电点是9.0。因此，在碱性条件下，抑菌活性和抗噬菌体的活性最低。对于E.coli，在pH 值为5.08.0 条件下，最低抑制浓度是2550 g/mL，而在pH 值为8.0 时最低抑制浓度大于200 g/mL2。同样，如果存在像偏磷酸这种阴离子聚合物的情况下也会降低- PL 的抑菌活性，其原因是降低了它的阳离子电荷。-PL 具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性和阴性菌如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌等的繁殖
12、有抑制作用，而对霉菌的抑制作用较小。-PL 作为保鲜剂具有安全性能高、在水中的溶解性强、热稳定性好、使用范围广以及不影响食品风味等优点，在中性和微酸性环境条件下均有较强的抑菌作用。由于对热稳定，加入后可热处理，因此还能抑制耐热性芽孢杆菌等。另外，S Shima 等认为，-PL 对一些呈蝌蚪状的非收缩性长尾噬菌体也有抑制作用3。值得注意的是, 具有高抑菌活性的-PL 至少必须有10 个以上赖氨酸单体，而且利用微生物合成的-PL抗菌活性高于化学合成的-聚赖氨酸（含有50 个赖氨酸单体）。三、-聚赖氨酸的应用一、作为食品防腐剂的应用-聚赖氨酸（-PL）作为一种天然食品防腐剂，因其良好的抗菌活性和热稳
13、定性而受到了广泛关注。聚赖氨酸对于大多数G+、G细菌、真菌及某些病毒具有强烈的抑制作用。（一）-聚赖氨酸的安全性-PL具有很高的安全性。小鼠急性口服毒理学研究表明-PL无毒性，细菌恢复突变测定表明-PL无致突变性。Hiraki等人在小鼠灌胃实验中发现，食物中添加高达20000ppm的-PL对小鼠生长并无明显副作用，-PL对于小鼠繁殖、神经胶质和免疫功能、胚胎和胎儿发育、后代的生长及其胚胎和胎儿发育无毒性。14C-标记的-聚赖氨酸的吸收、分布、代谢和排泄研究（ADME）表明，-聚赖氨酸在肠胃中的吸收极差，经168小时的排泄，放射性全部消失。通过自动放射能照仪观察，-聚赖氨酸在各组织和器官中没有积
14、累。 1989年日本Chisso公司首先用生物技术方法工业生产聚赖氨酸，从1989年起聚赖氨酸允许在日本作为食品添加剂使用（卫生、劳动和福利部现有食品添加剂名单），以后韩国也允许其作为食品添加剂使用。在日本，-聚赖氨酸在多种食品如米饭和面条的防腐方面，具有长期安全使用的历史。例如，将-聚赖氨酸以10005000ppm的浓度喷雾或浸泡鱼片或寿司，在许多传统日本食品中-聚赖氨酸用量达500ppm的浓度。另外，日常消费的食品如米饭、面条原汤、其他汤料、面条和炒菜通常含-PL10500ppm。-PL还用于Sukiyaki（日本牛排）、土豆沙拉、蒸蛋糕、卡士达酱的防腐。2004年，-PL被美国FDA批准
15、用于米饭和寿司的防腐，推荐用量为550ppm。 （二）-聚赖氨酸的适用范围-PL用于食品防腐时，可单独使用或与其他食品添加剂配合使用。常用的食品添加剂有甘氨酸、酒精、醋、磺酸月桂脂。复配使用可大大提高-PL的防腐性能。例如，当-PL与甘氨酸复配用于浓缩牛奶的防腐时，可观察到协同抑菌效果，使添加到食品中的防腐剂的总量得以降低。-聚赖氨酸在奶制品中的防腐保鲜作用 徐红华等人通过饱和实验设计研究了-聚赖氨酸和甘氨酸对牛奶的保鲜作用，结果表明，单独使用-聚赖氨酸和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使用的效果。混合使用时其增效随二者用量的增加而增加；但当-聚赖氨酸用量过高时，这种增效会有所减弱。其中添加420mg/L-聚赖氨酸和2% 的甘氨酸抑菌效果最佳。-聚赖氨酸在淀粉类食品中的防腐保鲜作用 日本学者腾井正弘在米饭中添加0.4%0.6%-聚赖氨酸-醋酸制剂研究对米饭的防腐作用，结果显示：30培养小时后，添加-聚赖氨酸的样品中细菌总数为6.010个/g，而空白样中细菌总数为3.6108个/g，表明-聚赖氨酸的醋酸剂有明显抑菌作用。-聚赖氨酸对动物性食品的防腐保鲜作用 腾井正弘将鸡肉等肉类浸渍在溶有0.12-聚赖氨酸甘氨酸制剂调味液中，再涂上面粉用油炸。这种鸡在30放置72小时，经细菌总数检测
