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1、环境工程微生物学实验指导书环境与市政工程学院环保实验室2007年 7月28日实验一 光学显微镜的操作及测微尺的使用一、实验目的1. 掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养2.观察细菌的形态，并学会测量细菌的大小。二、实验原理1显微镜的结构和各部分的作用显微镜分机械装置和光学系统两部分(图11)。(1)机械部分 镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜简有单筒和双筒两种。双筒者可调节两筒之间的距离，以适应不同瞳距者使用。转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。
2、两旁有弹簧挟用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式(可改变倾斜度)两种。镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。调节器：调节器包括大、小螺旋调节器(调焦距)各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。 (2)光学部分目镜：一般使用的显微镜具有23个目镜，其上常刻有“5x”、“l0x”或“15x”等数字及符号，意即使用时可放大5倍、l0倍或15倍。观察微生物时常用放大l0倍或15倍的目镜。物镜：物镜装在转换器上，可分低倍镜、高倍镜和油镜三种，其相应的放大倍数常是10、40、100。物镜的性能由数值孔径(num
3、erical aperture，NA)决定，数值孔径n.sin/2其意为玻片和物镜之间的折射率n乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n是影响数值孔径的因素，显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。聚光器：聚光器安装在载物台的下面反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器可上、下调节，以求得最适光度。案光器还附有虹彩光圈，推动把手可随意调整透进光的强弱。合理调节案光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。反光镜：反
4、光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镑。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。有的显微镑不具反光镜，使用的是电光源。滤光片：可见光由各种颜色的光组成，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 三、实验装置与设备1.实验设备（1）生物显微镜。（2）测微尺四、实验步骤1显微镜使用方法(1)低倍镜的使用法a.置显微镜于固定的桌上。b.旋动转换器，将低倍镜移到镑
5、筒正下方，和镜筒对直。c.转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜仔细观察，使视野亮度均匀。d.将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中。e.将粗调节器向下旋转(或载物台向上旋转)，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。f.左眼向目镜里观察，将租调节器向上旋转，如果见到目的物但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。g.如果粗调节器旋转得太快，使超过焦点，必须从第e步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。h.观察时两眼同时睁开，如用左眼看显微镜，有眼看桌上纸张，便可一面看一面画出所看到的物像。(2)
6、高倍镜的使用法使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正处。旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了,换高倍镜时基本可以看到目的物若有点模糊，用细调节器就清晰可见。 (3)油镜的使用方法如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。在载玻片上滴一滴香柏油(或液体石蜡)，将油镜移至正中使油镜镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调(切记不用粗调节器)即可。用油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油擦净、纸蘸少许二甲苯擦试镜头，再用擦镜纸揩干。(4)显微镜的
7、保护法显微镜应放在干燥的地方，使用时需避免强烈的日光照射。物镜和目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩干。用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。2目测微尺、物测微尺及其使用方法(1)目测微尺 目测微尺是一圆形玻片，其中央刻有5mm长的、等分为50格(或100格)的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数及镜筒长度而定。使用前用物测微尺标定，用时放在目镜内。(2)物测微尺 物测微只是一厚玻片。中央有一圆形盖玻片。中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，每格为10um，用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。(3)目测微尺的标定 将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上使刻
8、度朝上，用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再求出高倍镜下目测微尺每格的长度。(4)菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺l格的长度算出菌体的长度和宽度。3细菌个体形态的观察 (1)严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观察各示范片，并用铅笔分别绘出其形态图。(2)选择一种细菌，量出其尺寸。五、实验结果1结果 分别绘出在显微镜下观察到的细菌形态，及细菌的尺寸。六、实验结果讨论(1)镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不是直接用
9、高倍物镜或油镜观察?(2)用油镜观察时为什么要在载玻片上满加香柏油?(3)为什么目测微尺必须用物测微尺标定?在某一放大倍数下，标定了目测微尺，如果放大倍数改变，它还需重新标定吗?实验二 原生动物及微型后生动物的观察一、实验目的1建立对活性污泥及常见微生物的感性认识，掌握微生物活体观察技术；2掌握根据微生物种类数量判别活性污泥的状况。二、实验原理污水处理厂活性污泥中含有大量的原生动物及微型后生动物，这些原生动物及微型后生动物可作为污泥活性的指示生物。利用生物显微镜对原生动物及微型后生动物进行观察，根据其种类和数量可判定活性污泥的活性。三、实验装置与设备1显微镜。2活性污泥。取自污水处理厂曝气池。
10、3l00mL量简、载玻片、盖玻片、玻璃小吸管、橡皮吸头、镊子。四、实验步骤1肉眼观察取曝气他的混合液置于100ml量筒内，直观活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能(30min沉降后的污泥体积)。2制片取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀污泥一小滴加到载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)。加盖玻片时应使其中央已接触到水滴后才放下，否则会在片内形成气泡，影响观察。3镜检在显微镜下低倍或高倍下观察生物相。(1)污泥茵胶团絮绒体 形状、大小、稠密度等。(2)丝状微生物 伸出絮绒体外的多寡。(3)微型动物 微型动物的识别参阅教
11、材。五、实验结果列举镜检的主要生物相，并绘制其生物图。六、实验结果讨论根据实验观察情况，试对污水厂活性污泥质量及运行情况作初步评价。实验三 微生物细胞的计数一、实验目的1掌握血球计数板的原理和使用方法；2能熟练使用血球计数半对微生物细胞悬液进行细胞计数。二、实验原理血球计数板(图3-1)是由一块比普通玻片厚的特制玻片制成的。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上备刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室，它的长相宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。计数室有两种规格：一种是大方格分成16中格，每一中格分成25小格，共400小格；另
12、一种是把一大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下： (1)16x25的计数板计算公式细胞数m1（100小格细胞数/100）x400xl0 xl000x稀释倍数 (2)25x16的计数板计算公式细胞数m1（80小格细胞数/80）x400xl0xl000x稀释倍数三、实验装置与设备显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液。四、实验步骤1稀释样品。为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含5个细胞。2取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分格匀的待测苗液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置510min即可计数。3将血球计数板置于载物台上
13、，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动细调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。现以16x 25规格的计数板为例，数四个角(左上、右上、左下、右下)的四中格(即l00小格)的酵母菌数。如果是25x16规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格(即80小格)，对位于格线上的酵母菌只计格的上方及左方线上的酵母茵，或只计下方及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每1m1菌液中所含的酵母菌数。五、实验结果将实验结果计入下表：重复试验4或5个中方格中总菌数稀释倍数菌液浓度（个/ml）123平均六、实验结果讨论根据实验体会，说明用血球计数板进行微
14、生物计数时，其误差来自哪些方面？如何避免?实验四 微生物纯种分离及初步鉴定（综合性实验）一、实验目的该综合性试验包括以下内容：（1）培养基的配制与高压蒸汽灭菌：目的是让学生建立微生物营养的概念，掌握营养琼脂培养基的制备方法和灭菌原理、方法，初步建立微生物试验的“无菌操作观念”。（2）细菌纯种分离、培养和接种技术：目的是让学生掌握从环境中分离微生物纯种，掌握纯种菌种的培养接种技术，）进一步树立无菌观念，学会无菌操作的实验技术。（3）细菌纯种的菌体、菌落形态的观察：目的是让学生建立对细菌菌落的感性认识，掌握对细菌菌落形态的描述方法，并通过菌落特征初步对细菌进行分类。（4）微生物的染色：目的是让学生
15、掌握细菌革兰氏染色的原理及方法，对细菌进行革兰氏染色的阴阳性鉴定。（5）过氧化氢酶的定性测定：通过此实验对纯种分离的细菌进行过氧化氢酶的阴阳性判定，加深对细菌胞外酶催化生物化学反应的感性认识。二、实验装置与设备1培养基的配制与高压蒸汽灭菌：(1)培养皿(直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯(2)纱布、棉花、报纸、牛皮纸。(3)pH试纸、洗液、10HCl、10NaOH。(4)牛肉膏、蛋白胨、氯化纳、琼脂、蒸馏水。(5)高压蒸汽灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。2.细菌纯种分离、培养、接种技术、菌落观察：(1)无菌培养皿(直径90cm)10套，无菌移液管1ml2支、10m11支。(2)营养琼脂培养基1瓶活性污泥或土壤或湖水菌稀释水90mLl瓶、9mL的5管。(3)接种环、酒精灯
