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1、肿瘤高分文章必备：细胞免疫荧光详细Protocol分享！细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号 分子蛋白的出核/入核的定位变化。在进行细胞免疫荧光过程中，需要 用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长， 进而进行细胞的免疫荧光。实验前准备：1.胰酶2.DMEM 细胞培养基3.细胞培养 12 孔板或者6 孔板4.爬片实验步骤：1细胞种板与细胞爬片制备：1) 细胞密度在 90%-95%左右，用预热胰酶消化细胞后重悬细胞 于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。2)取细胞培养 12 孔板，在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小， 先在每个孔里准备放爬片的位置
2、滴几滴培养基，然后将爬片置于液滴 上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞 悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细 胞密度种入 12 孔板培养板内。3）24h 或者 48h 后，根据细胞生长速度快慢，观察判断细胞密度，约90%时进行细胞免疫荧光。2细胞的固定及免疫荧光1）吸除培养基，一般先加入PBS浸洗细胞3次，每次5 min。2）向孔内加入4%多聚甲醛1ml，进行细胞固定，室温固定20分 钟。3）吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗3次，每次5 min。4）向孔内加入0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透20min，目 的是使细胞通透。5）除
3、去Trit on X-100，使用PBS浸洗3次，每次5 min。6）用10%的与二抗同源的山羊血清（PBS配制）或者5%BSA封闭2 小时（选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致）。封闭后不 需要用PBS清洗。7）吸去封闭液，向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗（第一次使用 抗体可以根据抗体说明书推荐浓度，后续实验可以摸索抗体的适宜浓 度），4弋湿盒内孵育过夜。8）吸去一抗，使用PBS浸洗3次，每次5 min。9）向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37弋，室温避光孵育1小 时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。10）吸去二抗，使用PBS浸洗3次，每次5 min。11）向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10mi n。12）使用PBS轻洗细胞3次，每次5 min,洗去多余的DAPI。13）取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射 器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。14）用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片， 注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。
