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1、细胞/组织蛋白提取和Western Blot2010.03.06 1、in vitro蛋白提取和电泳样制备1.1煮沸法速度最快，操作简单，蛋白保存较完整操作步骤：1、用PBS洗细胞1-2次。1、 在细胞培养皿/板上直接加入1*样品buffer。*buffer用量：6孔板 80300l/孔；10cm大皿 200500l/皿2、 用细胞刮刮取细胞。3、 -8037循环冻融3次。 *-80约2min，只需要样品刚好冻结即可；37水浴10min。4、 沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80。1.2反复冻融法对于小分子量蛋白提取较有利试剂：PBS、cocktail液、
2、sample buffer器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、37水浴锅、沸水浴、冰盒操作步骤：1、用PBS洗细胞1-2次。2、在细胞培养皿/板上直接加入含cocktail的PBS（1：200）。*buffer用量：6孔板 80300l/孔；10cm大皿 200500l/皿。3、用细胞刮刮取细胞，转移至对应离心管中。4、-8037循环冻融3次。 *-80约2min，只需要样品刚好冻结即可；37水浴10min。5、 离心10 000r，4，10min，取上清。6、加入sample buffer，沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80。
3、1.3裂解液裂解1.3.1提取总蛋白试剂：PBS、细胞裂解液（如RIPA等）、cocktail液、sample buffer器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、沸水浴、冰盒操作步骤：1、用PBS洗细胞1-2次。2、在细胞培养皿/板上直接加入含cocktail的裂解液（1：200）。*裂解液用量：6孔板 80300l/孔；10cm大皿 200500l/皿。3、用细胞刮刮取细胞，转移至对应离心管中。4、 离心10 000r，4，10min，取上清。5、 加入sample buffer，沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80。1.3.2提
4、取核蛋白试剂：PBS、bufferA、bufferB、cocktail液、sample buffer器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、沸水浴、冰盒操作步骤：1、 按照配方配制了bufferA和bufferB。2、 1ml冷PBS刮取120*106细胞，常温离心10 000r，10s，小心弃上清。3、 400600l bufferA重悬沉淀，置于冰上裂解细胞，10min。4、 剧烈震动10s（speed5-6，频率很重要），将离心管放回冰上，常温离心10s，尽量完全弃上清。5、 向沉淀中加入3050l 预冷bufferB，冰浴20min。6、 离心10 000r，4，
5、10min，将上清转移至洁净离心管中，剩余数微升，测定蛋白含量（核蛋白浓度大约2-3mg/ml）。7、 将10-20l置于冰浴（dry ice）上冷冻后，保存于-20*要求提取速度尽量快，一次提取平行样不超过6个。*但我做了几次，发现沉淀粘糊糊的一块，不能溶解在bufferB中，那么如何才能提出核蛋白呢，郁闷！还有一个问题想请教，提取蛋白一定需要液氮研磨成粉状然后转移到裂解液中吗？我是直接在研钵中利用裂解液研磨组织，然后用枪吸到离心管中离心的，这样有问题吗？加了B后沉淀不会全溶的，那种情况正常。测一下蛋白浓度，很高的。2、in vivo蛋白提取和电泳样制备试剂：PBS、细胞裂解液（如RIPA等
6、）、cocktail液、sample buffer器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、沸水浴、冰盒操作步骤：1、 将组织样品称重后，按5-10%（w/v）比例准备好组织匀浆液。*匀浆液可以为PBS或细胞裂解液（按1：200体积比加入cocktail）2、将样品置于匀浆器上部球状凸槽内，用手术剪剪碎，用移液器加入匀浆液将组织碎片冲入匀浆管中，于冰上匀浆3-5min。3、将匀浆液用移液器移至合适规格的离心管中（一般为1.5ml），离心10 000r，4，10min，取上清。4、加入sample buffer，沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-2
7、0/-80。*本人在2010年初实验采用预冷的PBS+cocktail作为匀浆液匀浆，WB效果也很好。3、蛋白浓度测定Bradford法操作简单，实验周期短。Lowry法测定更加精确。3.1 Bradford法试剂：Bradford工作液、蒸馏水、标准蛋白（如BSA）器材：移液枪和对应枪头（1ml、20l）、分光光度计操作步骤：1、梯度浓度标准蛋白溶液、待测蛋白样品0.1ml，分别置于1.5ml离心管中。 *对于细胞蛋白，一般取2-5l稀释至0.1ml；组织蛋白，取1-2l稀释至0.1ml。2、 向每管样品中加入1ml Bradford工作液，静置1min。3、 在30min内A595nm测定
8、样品吸光度。4、根据标准曲线，计算出待测蛋白样品浓度。3.2 Lowry法试剂：ABC液、蒸馏水、标准蛋白（如BSA）器材：移液枪和对应枪头（1ml、20l）、离心管、50水浴锅、分光光度计操作步骤：1、 梯度浓度标准蛋白溶液、待测蛋白样品0.2ml，分别置于1.5ml离心管中。2、 加入A液0.18ml/管，50，水浴10min，置于室温冷却。3、 加入0.02ml B液/管，混匀，室温下静置10min。4、 加入0.6ml C液/管，剧烈混匀后，50，水浴10min，置于室温冷却，反应体系终体积为1ml。5、 在650nm处用1cm比色皿测吸收值，置信区间为0.20.8。4、SDS-PAG
9、E4.1电泳模具的清洗和安装电泳硅化玻板使用后用海绵蘸洗涤剂轻轻洗净，用二次水润洗后置烘箱烘干（或直接用吹风机吹干）。按照安装步骤安装磨具，灌胶，放梳子，拔梳子，取出玻片间密封胶条，再次装好磨具。4.2分离胶制备灌装计算公式X%分离胶 10mlA液 X/3mlB液 2.5ml一次水 （7.5-X/3）ml10%AP 50-100lTEMED 5l（10，if X8%）操作步骤：1、 根据所需目的蛋白的大小，确定X值，按计算公式计算配制分离胶。2、 用1ml移液器将分离胶液灌装至玻板中，并用一次水（或？问dongzi）封闭。3、 等待分离胶凝结，会出现胶和封闭液界面，将封闭液直接倒出，准备灌入堆
10、积胶。*AP置于干燥罐内，且越新鲜催化效果越好，1年以上的应弃用。*对于分离胶和堆积胶，室温下凝集时间约20min左右，冬季室温低，可置于40烘箱中，敞开箱门（防止凝集过程产生气泡）促使胶凝集，大约需要20min。4.3堆积胶制备灌装5%堆积胶 5ml（这一浓度最为常用）A液 0.67mlC液 1.0ml一次水 2.3ml10%AP 50lTEMED 5l操作步骤：1、 按照配方配制堆积胶。2、 用1ml移液器将堆积胶灌装入玻板中（完全灌满玻板间剩余空间）。3、 插入洁净的梳子，等待胶凝集，大约需要20min左右。4、 待堆积胶凝集后，进行电泳。*该步结束后，可以将梳子和胶条取下（参见4.4操
11、作），将玻板用滤纸包裹好，浸润于1*电泳液中，用塑料袋包好后密封，置于4保存，可以保存48h。4.4电泳操作步骤：1、 将梳子拔出，注意要垂直拔出，避免玻板间产生气泡。2、 将玻板拆下，取出两块玻板间的密封胶条。3、 将电泳槽倾斜，使得玻板下的气泡排出，在补入足够的电泳液到内槽，再进行加样操作。气泡电阻大，通电后，严重影响电泳效率。4、 上样，并点上marker。5、 电泳条件 80v （正常电流for 2块胶27mA左右，for 1块胶 16mA左右）堆积胶，耗时20min左右；120v（正常电流for 2块胶27mA左右，for 1块胶 16mA左右）分离胶，耗时1h左右。5、Tricin
12、e梯度胶适用于小分子量蛋白分离操作步骤：1、 Pouring Gels For each minigel (Hoeffer Mighty Small or BioRad Mini Protean-II-scale up as required): 1. Separating gel: 15% gel10% gel2 ml separating acrylamide 2 ml gel buffer 2 ml 50% glycerol 1.22ml separating acrylamide 2 ml gel buffer 2 ml 50% glycerol 0.78 ml waterpolyme
13、rize with 75 ul 10% APS and 7.5 ul TEMED 2. Stacking gel:0.25 ml stacking acrylamide 0.75 ml gel buffer 2.0 ml water 20 ul 10% APS 2 ul TEMED Polymerize both the stacking and separating gels at the same time (I used small disposable tubes), and pour stacking gel directly onto the separating gel (pou
14、r carefully but quickly-they wont mix but the separating gel polymerizes within 2-3 minutes). Make each separating gel mixture separately and add TEMED and APS right before pouring. Multiple stacking gel mixtures can be made in the same tube, but you have around 10 minutes before these start to poly
15、merize too. 加入分离胶后立即加入堆积胶。Sample loading and electrophoresis: For the minigels, 5-10 ul per well gives best results. Layer the samples in the well very carefully, and be sure to flush out any unpolymerized acrylamide before loading. 上样量5-10 ul达到最佳分离效果。Electrophorese at 25-35 mA (constant current) per gel in minigel setup. Foam will appear on the top (cathode), and
