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1、肿瘤干细胞的抗辐射性肿瘤干细胞概念在放射生物研究和临床治疗中的应用一、临床放射生物学对肿瘤干细胞的基本认识从1895年伦琴发现X射线至今已过去了100多年，百余年来放射学领域发生了巨大变化。随着放射生物学研究的进展，产生了许多重要的放射生物学研究成果，影响并推动了肿瘤的放射治疗。其中有关肿瘤干细胞的概念及其与放射生物研究和放射治疗的关系至今仍具有不可忽视的影响力。1. 概述多年来的生物学研究已经认识到：在生物体的发育过程中，所有细胞都起源于一个祖细胞(a single progenitor)或受精卵细胞(fertilized oocyte)。随着这个细胞的分裂，子代细胞进入不同的定向分化路径1
2、。在低等有机体，如水螅和涡虫，多潜能的干细胞(the stem cells)遍及全身。因此损伤之后，如肢体、眼或脑的丢失不是致死的，附近的干细胞可以使丢失的结构再生。放射生物学早期对肿瘤干细胞的知识，主要来自对白血病和骨髓细胞的研究。1958年Hewitt 2采用尾静脉注射的方法对同基因型小鼠进行了小鼠白血病移植实验，他不断地对细胞悬液稀释以确定成功接种白血病所需的最小细胞数。他发现成功率与细胞数之间的关系是S形的。认为50%肿瘤的发生概率是3个细胞。在以后的实验中发现这种推测有些天真， 3个或更多的细胞不能合作产生新的肿瘤，曲线的形状也与先前的这种解释不一致。曲线提示所移植的4个细胞中只有1
3、个细胞是产生肿瘤的肿瘤形成单位(tumor forming unit, TFU),它独立于其他3个细胞而产生肿瘤。同样，在CTUs中,1000个骨髓细胞中的一个(1/1000)骨髓干细胞具有完整的再生能力，能生成脾克隆。1961年Till和McCulloch的实验为辨认造血干细胞的功能和特性提供了进一步的依据。用放射线对小鼠进行致死剂量的全身照射后，通过骨髓细胞移植技术他们看到只有极少数的细胞能自我复制并具有广泛的增殖潜能，产生能表达不同分化特征的细胞克隆谱系，一些克隆形成红细胞，而另一些克隆形成粒细胞。这种具有自我复制和广泛增殖潜能的细胞被称为造血干细胞。对造血干细胞及血液系统肿瘤的研究大大
4、推动了对实体肿瘤干细胞的认识。 1970年代以前，放射生物学对人肿瘤细胞增殖的认识主要依据细胞群体动力学的研究，意识到肿瘤细胞群体中的大多数细胞的增殖能力不是无限的，认为进一步的深入研究应着眼于具有无限增殖潜能的特殊细胞亚群(既干细胞亚群)。为此，提出了肿瘤干细胞的概念。2. 肿瘤干细胞的概念：多数放射生物学者认为用“细胞更新的等级制约(cell renewal hierarchy)”概念和肿瘤生长的干细胞模型可以比较好的解释肿瘤干细胞的概念以及与实体肿瘤治疗反应性的关系。1)细胞更新的等级制约(cell renewal hierarchy)大多数放射生物学者认为：大部分人类实体肿瘤源于不断更
5、新的上皮组织，在上皮组织中细胞的丢失是一个正常的过程，即组织内分化的功能细胞持续不断地被更原始的细胞的增殖所取代，这个过程称为细胞更新的等级制约，也称为细胞更新的等级制约系统。大多数上皮来源的肿瘤组织不同程度地保留了这种特性。在这个系统中，干细胞处于关键位置具有两个主要功能，第一，自我更新(self renewal )，这是干细胞的主要特性；第二，启动细胞的初次分裂及其子代细胞群的分化过程，这个过程称为克隆膨胀(clonal expansion)。在细胞更新等级制约系统内部，细胞呈连续的、无序的等级变化。当细胞进入下一个分化层次时，逐步呈现与组织特异功能相关的分化特征。随着细胞分化过程的不断进
6、行，细胞的增殖潜力逐渐丢失。在细胞更新等级制约系统的两端分别是具有最大增殖潜力的干细胞和丧失增殖能力的终末分化细胞。两者间是中间层次的细胞，它们构成肿瘤组织的主要成分。由于缺乏明确的、清楚的标志物可以辨认干细胞，因此经典干细胞概念是一个功能性的概念。2)人肿瘤生长的干细胞模型( The stem cell model of human tumor growth)Mackillop 等3在1983年提出了人肿瘤生长的干细胞模型，这个模型是以肿瘤细胞克隆形成分析(clonogenic assay)实验为基础的，主要目的是将细胞更新理论用以解释人肿瘤的生长，以加深对现代实验技术和肿瘤细胞克隆形成分析
7、实验的理解。(1)模型的理论前提根据细胞更新的等级制约理论，假定在肿瘤组织的细胞群体中有3类细胞，不增殖的终末分化细胞(end cells)；增殖,但没有自我更新能力的转化细胞(transitional cells)；增殖，且有自我更新能力的细胞，即干细胞(stem cells)。(2)影响肿瘤细胞群干细胞比例的因素根据上述基本概念，可以认为：肿瘤组织的细胞群体是由具有无限增殖潜能的干细胞、具有有限增殖能力的非干细胞以及没有增殖能力的终末细胞构成的异质性细胞群体。有4种因素可以影响这些细胞亚群的大小，干细胞自我更新的概率()；转化细胞进一步分裂的潜力，它被定义为克隆膨胀数；每个亚群细胞丢失的相
8、对效率，用细胞丢失因子表示(，,)；单个干细胞增殖的代数。(3)人肿瘤生长的干细胞模型：人肿瘤生长的干细胞模型的基本特征通过以下假设及简单举例予以说明：1） 存在3个主要细胞类型，干细胞(S)，转化细胞()和终末细胞()。2） 只有干细胞具有自我更新能力，自我更新可在每次干细胞的分裂中产生，概率为，产生2个新的干细胞。3） 存在着转化细胞的亚类，第一亚类由干细胞的分裂产生， 两个新细胞的概率为=1-，细胞通过次正确的细胞分裂进行克隆膨胀，每次分裂产生新的转化细胞亚类。 PS 4） 终末细胞不能增殖，只能由转化细胞产生，是克隆膨胀的最终结果。5） 所有具有增殖能力的细胞具有相同的代际时间(gen
9、eration time )。6） 统计学波动忽略不计，因此是随机变量，每类细胞数可用他们的期望值辨认。7） 起始时间t=0，干细胞数S=0，没有终末或转化细胞存在。因此T(0)=EC(0)=0.8） 干细胞的自我更新概率，在给定细胞群的所有干细胞是相同的。9） 对给定细胞群而言，克隆膨胀数n是一常数，并独立于P 。10） 每代可能来自干细胞、转化细胞或终末细胞亚群的细胞丢失概率，分别是，, 。此概率在每个细胞亚群内的所有细胞是相同的，令：11） 在设定情况下，整个肿瘤生长期间概率，,，克隆膨胀数n以及代际时间是常数。在这个模型中时间变量，是指固定代际时间的总倍增，每个细胞类型的期望细胞数由下
10、式给出： (1) (2) ( 3) . . (4) (5) 每个代际时间以后，细胞进程的每个组群 贯穿后续的转化细胞亚群，直至终末细胞的形成。所累积的最终数目，就是完成n次分裂转化细胞每个组群与新增终末细胞之和。任意时间的每个细胞类型的细胞数可通过替换得到，如等式1与等式2以及等式2与等式3，0和t 之间的所有时间间隔可被代入计算，令得到： (6) (7) . (8) . (9) 等式(6)和(8)用于计算每个亚群的转化细胞数，如果 ，则。如果 ,则转化细胞的总数为： (10) 如果是终末细胞总数，则： (11) 对大的值，干细胞数和细胞总数平行增加，从而在等式中达到平衡，因此，它也可表示为:
11、于是： (12) 由等式(12)的倒数，得到干细胞与总细胞的比例。 (13)二、肿瘤干细胞对放射治疗的反应性临床放射生物学对肿瘤干细胞治疗反应性的认识主要源于两项重要实验技术的发展，1)体外培养细胞的克隆形成分析(clonogenic assay)，2)采用放射自显影术(autoradiography)进行的细胞动力学研究。1956年Puck 和Marcus用Hela S3细胞通过细胞克隆形成分析技术绘制了第一条体外培养肿瘤细胞的细胞放射存活曲线，定量研究和评估放射线对细胞增殖能力的影响，用以反映和推测放射线对肿瘤的控制效果。1. 细胞存活曲线：1)细胞存活曲线的概念：毫无疑问，放射线照射后可
12、以引起大量细胞的死亡，但放射治疗却对受照射后的“存活细胞”更加关注，因这对放射可治愈性非常重要。细胞存活曲线(cell survival curves)：是描述放射线照射剂量和细胞存活分数(surviving fraction)之间的关系，用以研究和评估电离辐射对哺乳动物细胞增殖能力(即再繁殖完整性,reproductive integrity)的影响，对放射生物学研究和临床放射治疗具有重要意义。讨论细胞存活曲线的意义，首先必须明确“细胞存活”的含意，即什麽叫“细胞存活”。对什麽叫细胞的存活与死亡，不同学科根据所研究的内容赋予了不同定义。因为临床放射治疗的目的是抑制肿瘤的继续生长、阻止肿瘤细胞
13、的繁殖传代，因此放射生物学规定：鉴别细胞存活的唯一标准是，受照射后细胞是否保留无限增殖的能力，即是否具有再繁殖完整性。在离体培养细胞实验体系中，细胞群受照射后，一个存活的细胞可以分裂繁殖成一个细胞群体(50个细胞)，称为“克隆(clone)”。这种具有生成“克隆”能力的原始存活细胞，称为“克隆源性细胞(clonogenic cell)。当然，这个定义是指那些正处于增殖状态的细胞而言的，对于那些不再增殖的已分化的细胞，如神经细胞、肌肉细胞、分泌细胞，只要丧失其特殊机能便是死亡。如果细胞在受照射后，形态完整、表面毫无损伤、有能力制造蛋白质或合成DNA，甚至还能挣扎着进行一次或少数几次有丝分裂，但由
14、于已经失去了无限分裂和产生大量子代细胞的能力，故依然被认为是死亡细胞。2)细胞存活曲线的临床意义：首先，它反映和推测的是肿瘤治疗的效果，是从实验角度评估疗效的较好指标；其次，在这个严格定义下，提示临床必须重视这种存活的克隆源细胞(干细胞)，这种具有近乎无限增殖能力的细胞是在治疗中必须根除的细胞，否则将留下复发和转移的隐患。而如何能更有效地消灭这种细胞则是临床放射生物和治疗学家多年来所需要共同关注和加以研究的。3)细胞存活曲线的形状：细胞存活曲线的形状随研究对象(细菌、酵母、哺乳动物细胞)的不同而改变，曲线还会受多种因素的影响。为更好地拟合哺乳动物细胞的存活曲线，已有不少生物数学研究者提出了数种数学模型，在此仅介绍在临床放射生物学研究中最常用的数学模型。(1)指数存活曲线：对于致密电离辐射(如中子、a粒子)，照射后它们的细胞存活曲线用单靶单击数学模型(是靶学说最基本的数学表达式)拟合后，在半对数坐标上是一条直线，呈指数型。其特点是只有一个参数，即值(为斜率的倒数)，通常称为平均致
