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1、米根霉发酵生产L-乳酸1 前言乳酸是一种天然有机化合物，它广泛地应用在食品、化工、医药品中，是一种重要的原料。乳酸可分为L-乳酸和D-乳酸两种类型，人体不能过多的摄入D-乳酸，过多的摄入会使新陈代谢发生紊乱。L-乳酸的聚合物是一种可降解的、具有良好韧性的新型材料，其原料为可再生资源。因此L-乳酸已近被认为最具发展潜力的材料。目前已经在社会上各个领域得到广泛的应用。目前社会工业上最主要生产的是L-乳酸，而且大都采用米根霉发酵法生产L-乳酸，这种方法具有操作简单、原料便宜、产物纯度高、菌种易于培养等优点。但由于技术不够高使其也有缺点，如生产的周期长、糖的转化效率太低、菌种易于结成团。抑制了工业上的
2、应用，因此必须解决上述问题，才能使米根霉发酵法生产L-乳酸在工业上得到广泛的应用。2 目的本实验的目的主要是认识米根霉发酵法生产L-乳酸的过程，掌握米根霉发酵产L-乳酸的方法，使学生对米根霉发酵法生产L-乳酸有感性的认识，并掌握葡萄糖及乳酸的化学测定方法。3 原理葡萄糖进入细胞内后，在细胞液中通过EMP途径被分解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下直接脱氢形成目标产物L-乳酸，其反应式如下：2C6H12O63C3H6O3 + C2H5OH + CO24 实验材料4.1 菌种 本实验所使用的菌种为米根霉(Rhizopus oryzae)。4.2 使用的主要试剂与仪器 实验试剂试剂名称 规格 葡萄
3、糖分析纯木糖 分析纯琼脂粉 生化试剂硫酸铵分析纯3,5一二硝基水杨酸分析纯七水合硫酸锌分析纯碳酸钙分析纯钙羧酸分析纯磷酸二氢钾分析纯结晶酚分析纯氯化钠分析纯氢氧化钠分析纯乙二胺四乙酸二钠分析纯无水亚硫酸钠分析纯盐酸分析纯酒石酸钾钠分析纯实验仪器名称SW-CJ-2F型超净工作台SHP-160D型智能低温生化培养箱HYG-B全温度摇瓶柜TU-1810紫外可见分光光度计LDZX-50KBS立体压力蒸汽灭菌器JZC-TSC电子计重天平CP114型电子天平DHG-9101-OS型电热恒温鼓风干燥箱HH-S恒温水浴锅BCD-209KHA型冰箱3L发酵罐5 培养基5.1 菌种斜面保藏培养基 取新鲜的马铃薯，
4、去皮以后称取200 g切成小块，加入1000 mL水，煮沸20 min以后(能用玻璃棒戳破即可)，用纱布过滤，在滤液中加入20 g琼脂粉和20 g葡萄糖，然后加热融化并补足失水至1000 mL。放置于高压蒸汽灭菌锅中121下灭菌15 min后，将其倒入三角瓶中冷却制成斜面培养基。 5.2 种子与发酵培养基(g/L)(1) 葡萄糖发酵培养基：葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、ZnSO47H2O 0.44 g/L、MgSO47H2O 0.25 g/L，CaCO3 40 g/L，pH值自然，以上培养基皆于121灭菌15 min。种子培养基葡萄糖为40
5、g/L。6 检测方法 6.1 EDTA法测定发酵液中乳酸的含量 （1） 溶液的配制 (1) 0.05 mol/L EDTA溶液：准确称取18.612 g的EDTA，加水溶解以后定容至 1000 ml。 (2) 钙指示剂：称取1 g钙羧酸和100 g的氯化钠，使两者充分混合后，保存在棕色瓶中备用。 （2） 实验方法 取l mL发酵液(V1)加入到盛有100 mL蒸馏水的三角瓶中，然后加入10 ml1 mol/L的NaOH溶液与少量钙指示剂，用0.05 mol/L EDTA溶液滴定。溶液由紫红色变为纯蓝色即为滴定终点，消耗EDTA溶液的体积记为V2。 （3） 结果计算 L-乳酸的含量(g/L)=(
6、90.080.1V1)/V2 V1:滴定到终点时消耗的EDTA溶液体积(ml) V2:X吸取的发酵液体积(通常为1 ml) 6.2 DNS法发测定酵液中残糖含量 由于单糖含有游离的酮基或醛基，具有还原性，因此单糖属于还原糖。而蔗糖和多糖等，由于不含游离的醛基或酮基，因而他们属于非还原性糖。多糖能够被水解为单糖，此时可以通过测定水解后单糖的含量来测定原来总糖的含量。发酵液中残糖的测定方法主要有菲林试剂法、高效液相色谱法和DNS法。本实验主要采用DNS法来测定发酵液中残糖的含量。 （1） 溶液的配制 DNS显色剂：准确称取酒石酸钾钠182 g、重蒸馏酚4 g、无水亚硫酸钠3 g、氢氧化钠20 g，
7、3,5二硝基水杨酸6.3 g，加水溶解以后定溶到1000 ml。将配置好的溶液倒入棕色试剂瓶中保存备用。 1%葡萄糖标准溶液：准确称取100 mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至1000 ml。 （2） 标准曲线的绘制取9只试管，编号为19。分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的1%葡萄糖标准溶液于8只试管中，加入1 ml的蒸馏水，然后分别加入DNS试剂1.5 mL。将各试管中的溶液混合均匀，放置于水浴锅中100加热5 min，取出后立即用流动冷水冷却至室温，再向各试管中加入21.5 ml蒸馏水，混合均匀。在540 nm光波波长下，用1号试管内的溶液调零，分
8、别测量28号试管内溶液的吸光度值，其添加量如表2.1所示。表2-1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量 项目12345678含糖总量(mg)00.20.40.60.81.01.21.4葡萄糖液(ml)00.20.40.60.81.01.21.4蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.6DNS试剂(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5加热沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.5吸光度(540nm)00.2180.4010.5880.7630.9471.1231.338 以葡萄糖毫克数
9、为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(图2-1)。 图2-1 还原糖的标准曲线 由上图可知标准曲线公式：y=0.9438x+0.0179 R2=0.9992 （3）发酵液中残糖的测定将发酵液离心过滤后稀释至合适的倍数(n)，取1.0 mL稀释后的发酵液，并用移液枪吸取蒸馏水1.0 ml放置于25 mL的刻度试管中混合，加入1.5 mL DNS，沸水浴加热5 min，迅速冷却后加水至25 mL，摇匀，于分光光度计540 nm下测其吸光值。 还原糖含量= Xn式中：n为发酵液稀释倍数；X为标准曲线上对应于吸光度的x轴值。 6.3 发酵液中生物量的测定先将发酵液过滤后的菌丝体用稀盐酸充分洗涤，除
10、掉过量的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤23次，放置于6080干燥箱中烘干至重量不在变化后称量22，并计算出菌体的干重(g/L)。7 实验步骤（1）每小组配制菌株保藏培养基200 ml、调整pH为7.0，进行灭菌，灭菌条件：12115分钟。灭菌结束后将培养基置于超净工作台中进行冷却， 待培养基冷却后挑取菌丝接种到培养基表面，进行菌株活化，培养条件：30培养3-4天。（2）配制种子培养基200 ml，调整pH为7.0，进行灭菌，灭菌条件：12115分钟。将活化后的米根霉置于无菌操作台中，加入无菌水，用接种环将孢子刮下，制成孢子悬浮液，然后将其稀释到适当的浓度(一般为110个/L)，加入到已经配置好的种子培
11、养基，接种量按发酵液的5 %添加。最后置于30，200 r/min的摇床上振荡培养。（4）配制发酵培养基1500ml，清洗发酵罐，将发酵培养基装入发酵罐中，然后再组装发酵罐。将种、装有培养基的发酵罐、无菌水及其它需要灭菌的材料进行灭菌，灭菌条件：12115分钟，灭菌结束后将罐取出，及时通入无菌空气，以保持罐内正压，防止染菌，并通入循环水，使发酵培养基冷却到30左右。（3）待种子培养进入对数生长期后将其转接到发酵罐进行罐发酵，设置搅拌速度、通气量、培养温度等参数。（4）随时关注发酵运行过程，在发酵进行过程中，每隔4h取样，测定DCW、残糖与乳酸含量。（5）待发酵结束后，将发酵罐进行拆卸并清洗实验
12、相关设备，然后再将罐进行复原。7 实验结果与讨论由图可知，米根霉利用葡萄糖为碳源时(质量浓度为80 g/L)，在刚开始发酵的一个时间段内，此时菌体还处于生长的延滞期，产乳酸能力不强，因而发酵液中L-乳酸的含量很低。当发酵时间在1836 h，米根霉进入了对数生长期，米根霉生长加速，菌体迅速增加，达到3.6 g/L。此时发酵液中L-乳酸的产量也随着米根霉菌体的大量增加而呈现上升趋势，达到45 g/L，同时，葡萄糖含量急剧下降，由80 g/L下降至22.8 g/L。当发酵至36 60 h时，米根霉菌株的生长进入稳定期，米根霉的生物量达到4.0 g/L。由于发酵液中的葡萄糖含量比较低，所以米根霉产L-乳酸的速率明显降低，乳酸含量由45.04 g/L增长到58.93 g/L。在发酵至66 h时，发酵液中葡萄糖已被大量消耗，残糖为3.30 g/L，此时米根霉的生物量达到最高为4.10 g/L。当发酵时间至72 h，发酵结束，发酵液中L-乳酸的积累量达到最高60.00 g/L，乳酸生产强度平均为为0.83 g/(Lh)，此时，可能由于发酵液中葡萄糖含量过低，各项条件已经无法满足米根霉的生长，从而米根霉细胞的生长进入衰退期，部分菌体出现死亡，糖的转化率为76.38%。
