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1、 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一）主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏课题背景：1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2H2O CO22NH33、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。一、研究思路（一）筛选菌株1、实例：DNA多聚酶链式反应（PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制
2、的技术，此项技术要求使用耐高温（93）的DNA聚合酶。该酶存在于水生嗜热菌（Thermus aquaticus)中。问题：为什么Taq 细菌能从热泉中被筛选出来呢？原因：因为热泉温度7080，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：（1）抑制大多数微生物不能生长；（2）造成有利于该菌生长的环境。结果：培养一定时间后，该菌数量上升
3、，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素4、培养基选择分解尿素的微生物的原理培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。（二）统计菌落数目计数法：直接计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法1、直
4、接计数法：最常用的显微镜直接计数法。显微镜直接计数：先将待测样品制成悬液，利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2、间接计数法（活菌计数法）（1）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。（2）常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数（CV)MC：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml
5、)，M：代表稀释倍数。例1、某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）（）A2.34108 B2.34109C234D23.4例2、两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要
6、，如何改进？分析：第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中第1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。启示：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。例3、样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。
7、测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释，根据这些数据，请你思考旁栏中的问题。当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将103107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30300间的平板进行计数。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？分析：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：
8、好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。3、统计菌落数目的注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。（三）设置对照：设置对照的主要目的是排除实验组中非测
9、试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：土样不同，培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质)方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不
10、可少的。典型例题例1、下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（）AKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水BKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、琼脂、水CKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、尿素、琼脂、水DKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水答案：A例2、统计菌落数目的方法有（）涂布平板法重量法直接计数法比浊法生理指标法膜过滤法ABCD答案：D例3、下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，正确的是（）A一般选用103107倍的稀液分别涂布B测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释C
11、测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释D当第一次测量某种细菌的数量，可以将101107倍的稀释液分别涂布到平板上培养答案：B- 返回 - 同步测试一、选择题1、使用选择培养基的目的是（）A培养细菌B培养真菌C使需要的微生物大量繁殖D表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2、下列说法不正确的是（）A科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最
12、大，种类最多。3、为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A较多的氮源物质B较多的碳源物质C青霉素类药物D高浓度食盐4、在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因（）由于土样不同由于培养基污染由于操作失误没有设置对照ABCD5、关于土壤取样的叙述错误的是（）A土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B先铲去表层土3cm左右，再取样C取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D应在火焰旁称取土壤6、下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是（）土壤取样称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中吸
13、取0.1mL进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度ABCD7、下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是（）A一般选用103107倍的稀液分别涂布B测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释C测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释D当第一次测量某种细菌的数量，可以将101107倍的稀释液分别涂布到平板上培养8、下列关于微生物的培养叙述错误的是（）A细菌一般在3037的温度下培养12dB放线菌一般在2528的温度下培养57dC霉菌一般在2528的温度下培养34dD不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间9、下列操作需要在火焰旁进行的一组是（）土壤取样称取土壤稀释土壤溶液涂布平板微生物的培养ABCD（三）安全预评价程序10、下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（）（五）规划环境影响评价的跟踪评价A以尿素为唯一氮源的培养基中加人酚红指示剂B以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂D以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂11、土壤取样时最好选择哪种环境中的土壤做分离细菌的实验（）A街道旁B花盆中（6）评价结论。C农田中D菜园里CBCACC BDDAD1.建设项目
