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1、实验 8 单向琼脂免疫扩散试验目的了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。原理将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。 抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两 者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小(直径或面积)与抗原浓度成正比。 以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。主要 用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。材料1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白2. 抗体：抗人IgG抗体3. 3%
2、琼脂凝胶、4.5 x 10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒(盒内铺有湿纱布)、 半对数坐标纸。方法1. 抗体琼脂板的制备(1) 将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。(2) 用0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56C水浴 保温。(3) 将上述在56 C中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12m l含抗体的琼脂倾注于放在水 平台上的塑料板上，待板冷却。此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。2. 稀释参考血清和待测血清;(1) 稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0
3、.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同 稀释度。例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。参考血清稀释度1： 101： 161： 20 1： 321： 40 1： 64IgG 相应含量为 1166728583364291182(2) 待测血清用生理盐水作1： 40稀释。3. 打孔 用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm,用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。4. 加样 打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀 释度加二个孔。用同样方法吸取10ul已稀释好的待测血清，每份标本加二个孔。5. 反应将加样的琼脂板平放在搪瓷湿盒
4、中，置37反应2448h。结果观察取出琼脂板，即可见清晰的乳白色沉淀环。用标尺测其沉淀环直径并记录。标准曲线的绘制 以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对 数纸上作图，绘制标准曲线。待测标本Ig含量的计算：以待测标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍 数，即得该标本Ig的含量注意事项1. 该试验为定量试验，因此，对各种影响因素，如参考蛋白的标准、抗体浓度、琼脂的质量与浓度、免 疫板的厚度与均匀程度等，必须严格控制。2. 制备琼脂板时，温度不宜过高，以免使抗体变性失活，但亦不宜太低，以免使琼脂凝固不均。3. 稀释抗血清、参考血清和加样时均需用微量加样器，加样量要准确，且每个样品加两个孔。4. 测量沉淀环直径务虚准确，若有误差，再乘以稀释倍数，则误差可成倍的增加。5. 标准曲线测定必需同时制作，不可一次作成，长期应用。图4-6单向免疫扩散试验示意图0100500100015002000抗原浓度(mg/lOOml)图斗-7单向免疫扩散试验标准曲线
