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1、一.菌种的保存重组DNA分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组 NA。通常采用宿主菌是大肠杆菌,根据不同载体需求,选用不同品系大肠杆菌1 概述:大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性,保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状,为菌种保藏提供了有利因此,而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变,给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化,主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象,菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平,使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、
2、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关,微生物代谢活力旺盛,它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。3 菌种保藏的原理是:通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外,
3、还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。4 常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。. 甘油低温保存法(70-196)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是:在-70或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0-70温度范围内,水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察,可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免070冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏,需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-7
4、以下低温中能减少冰晶形成,甘油对细菌无毒性,分子量小,溶解度大，易穿透细菌ii使用浓度范围为5%-0%,一般常用0。在保存瓶中按1：1加入60的甘油和菌液,混匀后贮存于-0或液氮中。复苏后细菌仍能生长,活力不受任何影响。二、菌种的复苏复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37培养8-2小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或 0冰浴中，用完尽快放回,接种时挑取表面已融化部分即可,不可全溶,因反复冻融会导致细胞壁破裂。切记:接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。三、大肠杆菌培养1.培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基
5、，常用B培养基。)LB（iBrtain)液体培养基配制精解蛋白胨(batorytone）.0%酵母浸出粉(bcto-extract)0.5%氯化钠.%搅拌使之完全溶解,用molNaOH（abut02ml/1000m培养基）调p至70,如用进口试剂可不必调， 高压灭菌mn(1200.pa)2)含琼脂的固体培养基配制(1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加.5%琼脂制成，先配液体培养基,然后加入.5琼脂,高压灭菌2mn,取出后再无菌状态下铺平板（2)选择性培养基：将消毒好的固体培养基置室温下冷却50时加抗生素或其他必加成分,摇匀后倒入灭菌皿中厚度-3m, 室温固化。 (抗生素用三蒸水溶解后,
6、用无菌滤头过滤到无菌瓶中,氨苄青霉素终浓度 5l/ml）新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放 23天，或37放半小时,然后保存备用。(3）LB培养基中所用抗生素终浓度:氨苄青霉素-l/l;氯霉素-20l/m；庆大霉素-1l/;卡那霉素-30lm;春日霉素-1000l/l；壮观霉素-10l/ml;链霉素30l/m；四环素-12l/l。注意：除了四环素保存-20,其余均应保存4，所有抗生素均应溶于无菌去离子水。四环素对光敏感2.液体细菌培养1）小量培养：(1)取灭菌 16 或 mm 口径培养管,加 -5mlLB 培养基,再加 50mgm 氨苄青霉素 3ul(宿主菌不加抗生素)（
7、2) 无菌牙签挑取单菌落,送入培养液中,或取菌液 5-ul,转入培养液中，封好管口(）37摇床培养100-0r/至生长饱和，约-12 小时2)大量培养：取 0m 培养瓶内装培养基 10200m,及相应抗生素。以0.-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养10200/min至O值0.60.8。3固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选,转化后抗性菌落的筛选。方法：采用划痕接种法。用接种环从菌种中沾取少量菌液,划线。内容总结(1）一菌种的保存重组 DA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中,通过细菌培养来扩增所需的重组 DNA(2). 微生物的变异速度,通常情况下，与其新陈代谢速度有关,微生物代谢活力旺盛,它的变异速度快，代谢活动微弱,变异速度就慢(3）贮存在70以下低温中能减少冰晶形成,甘油对细菌无毒性,分子量小，溶解度大,易穿透细菌ii.使用浓度范围为15%50%，一般常用30
