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1、涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/ 阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用的讨论 一、抗菌肽在C阴道局部免疫中的作用 女性下生殖道为开放性腔道,正常情况下是以乳杆菌等优势菌为主要组成的微生态系统,当受到内源性和外源性因素影响时,很容易发生改变,导致疾病的发生。C主要由白假丝酵母菌引起,此菌为条件致病菌,其致病性与宿主的免疫状态关系密切,对假丝酵母菌感染的防御机制目前尚不十分清楚。多数研究认为,是阴道局部而不是全身性细胞免疫在宿主的抗感染机制中发挥重要的作用,所以阴道黏膜固有的免疫机制已受到学者的关注。 研究发现,人体基因组中存在近千种编码具有抗生素样活性蛋白的基
2、因,这些基因编码的短肽富含带阳离子的氨基酸残基,称之为“肽抗生素”或“抗菌肽”。抗菌肽可以直接消灭病原体并且可调节宿主免疫和其他生物学反应。女性阴道中抗菌肽的存在及其对抗假丝酵母菌的作用已被许多研究所证实。在体外实验中发现,阴道黏膜上皮细胞对假丝酵母菌有一定的自然抵抗性,在假丝酵母菌刺激下其会分泌具有杀伤作用的抗菌肽,同时促进局部特异性细胞免疫的建立。抗菌肽分泌量的增加对杀灭假丝酵母菌起到重要作用,也是防止C反复发作的有利保障。防御素家族中HD5除了在肠道黏膜表达以外主要在女性生殖道的复层上皮细胞表达,包括阴道、宫颈、子宫内膜和输卵管,在胎盘和胎膜中也证实有H的存在。人源阳离子抗菌肽18(hC
3、AP-18)是存在于人体的一种抗菌肽,hCAP-18是前体形式,而LL-37则是有活性的成熟形式。这两种抗菌肽对假丝酵母菌都有较强的杀灭作用,并且在阴道上皮细胞中表达量高,故本研究以这两种抗菌肽为研究对象,在前期实验中也证实,C患者阴道冲洗液中HD5及IL37的含量均有升高,但在复发性C患者阴道冲洗液中的含量却呈下降趋势,证明抗菌肽的表达下降可能与C的反复发作有关。二、阴道上皮细胞转染HD5、LL-37真核重组质粒后HD5、LL-37的分泌情况。本研究原代培养的阴道上皮细胞稳定传代至第4代后,将人I合成的带荧光蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP禾口pcDNA3.1(+)
4、/LL-37GFP转染细胞,结果证实,体外培养的阴道上皮细胞经转染质粒pcDNA3.1( +)/LL-37-EGFP或(禾口)pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP后,分泌LL名7及HD5的水平较未转染者明显增加。这种增加趋势在带菌组中更加明显,其中联合转染细胞分泌的LL37、HD5水平最高,说明阴道上皮细胞自身有一定水平的抗菌肽分泌,但这种分泌是一种持续的低水平稳定状态,假丝酵母菌的存在能促进阴道上皮细胞抗菌肽的分泌,而转染质粒后LL-37、H“分泌水平明显增加,其中带菌组的联合转染亚组分泌水平在各时段均为最高值,峰值出现在转染后zh,说明转染zh时HD5和LL-37分泌水平最高。这与Ke
5、hlle等的研究结果一致,即防御素表达的增加可以有效地抵御假丝酵母菌的侵袭,同时将感染限制在上皮的表层。本研究证实,阴道上皮细胞对假丝酵母菌有天然的抵抗作用,但自然状态下抗菌肽的分泌量有限,感染后抗菌肽的分泌量会增加,但增加的量不足以抵抗假丝酵母菌对上皮细胞的侵袭,阴道微生态平衡被破坏,对一些抗假丝酵母菌药物产生耐药,则出现反复感染及难治性C。二、阴道上皮细胞转染HD5。LL-37重组质粒后对假丝酵母菌的抑制作用。抗菌肽抗假丝酵母菌的机制主要是在真菌细胞膜上形成离子通道,破坏胞膜的完整性造成细胞死亡。本研究利用葡萄糖消耗法检测阴道L皮细胞对假丝酵母菌的抑制效果,在葡萄糖低浓度时,假丝酵母菌必须
6、消耗能量以主动运输方式来转运葡萄糖进人细菌胞体内,由于HD5及LL37对其的抑制和消灭,假丝酵母菌细胞能量代谢水平低下,无法摄取足够的葡萄糖。葡萄糖消耗百分率与假丝酵母菌细胞受抑制程度呈反比,通过比较不同细胞不同时段培养上清液中的A值反映葡萄糖的剩余量,以数值形式客观地反映假丝酵母菌的代谢水平,进而比较阴道上皮细胞的抑菌效果。本研究不同时段带菌组中联合转染亚组抑菌效果(A值)明显高于其他各亚组,随时间延带菌组中各亚组A值均呈下降趋势,假丝酵母菌消耗的葡萄糖量逐渐增多,但联合转染亚组A值下降趋势较转染一种质粒或未转染质粒的亚组缓慢,说明联合转染质粒后由于LL-37及HD5分泌量最多,阴道上皮细胞
7、对假丝酵母菌的抑制率也最高。证实转染两种质粒有协同促进作用,使LL-37及H的分泌水平均增加,并且使阴道L1皮细胞抵抗假丝酵母菌的能力显著增强。这与“lDcz Garca等:IO将LL-37加人白假丝酵母菌的体外培养纂中、LL-37表现出抑菌作用的结果一致: 此外,倒置显微镜下观察假丝酵母菌生长的状况,发现联合转染亚组假丝酵母菌生长密度无明显增加,转染质粒48h后仍有大量上皮细胞存活,而未转染亚组假丝酵母菌生长活跃,阴道上皮细胞损失殆尽。由此更加证实人工转染真核重组质粒后,LL37及HD5的分泌明显增加而彐具有活性,抑制了大部分假丝酵母菌的生长,阴道上皮细胞对假丝酵母菌的抵抗性显著增强。研究证
8、实,抗菌肽抗真菌的最初作用位点在胞膜上Ll“ll。除了通过肽-膜脂质通路机制破坏假丝酵母菌外,防御素和LL-37也可通过结合内毒素抑制细菌的脂多糖,或者通过抑制细胞内程序直接作用于微生物内部抑制DNA和蛋白质的合成。抗菌肽是否还存在其他抗菌机制有待进一步研究。 四、阴道上皮细胞转染抗菌肽重组质粒后对细胞因子的调节作用 抗菌肽作为先天性和获得性免疫之间的桥梁,通过上皮细胞产生细胞因子诱导获得性免疫。IL-8是上皮细胞对炎症应答时产生的一种细胞因子,是炎症趋化因子中最有代表性的成员,能扩张血管增强通透性,促进吞噬细胞和血管内皮细胞黏附,促进炎性细胞穿越毛细血管到达感染部位,并使之活化,增强吞噬杀伤
9、能力。免疫细胞和非免疫细胞通过直接或间接作用抵抗黏膜感染,包括识别假丝酵母菌、调节炎性反应或产生直接抗真菌的效应功能。 研究证实,感染及非H患者感染假丝酵母菌后,其阴道冲洗液中IL沼的含量显著高于正常对照组|145。HD5可以诱导结肠细胞系分泌IL-8:16,L37也可以刺激髓细胞及上皮细胞细胞因子尤其是IL蔼的产生:。本研究证实,体外培养的阴道上皮细胞感染假丝酵母菌后其分泌HD5和LL-37的水平增加,从而刺激上皮细胞分泌IL-8增加,当转染HD5和LL37重组质粒尤其是联合转染质粒后,IL蔼分泌水平增加的趋势更加明显。说明HI,及LL-37均可刺激阴道上皮细胞分泌炎症趋化因子蔼,增加血管通
10、透性,促进炎性细胞到达炎症部位,通过免疫调节方式增强阴道上皮细胞对假丝酵母菌的抵抗作用。LL-37和HD5具有免疫调节功能并可诱导炎症趋化因子IL-8的分泌。细菌被抗菌肽短暂渗透后仍保留活性,因此仅有通透性改变并不能预测其抗真菌活性。“pezGarcfa等证实,LL-37可以中和内毒素,并对白细胞有化学趋化作用,可以提供其他的杀菌方式,说明膜渗透作用并不是抗菌肽杀菌的惟一机制。 来源于黏膜感染的疾病正在威胁人类,作为先天性免疫的一部分,抗菌肽具有广谱抗微生物特性且无毒,无耐药性。本研究成功将LL-37及HI,s真核重组质粒转染阴道上皮细胞并获得稳定表达,不仅增强了阴道上皮细胞对假丝酵母菌的直接抵抗能力,而且通过增加炎症趋化因子IL-8的分泌,间接调节宿主细胞的免疫能力。为进一步探讨阴道上皮细胞对假丝酵母菌的先天性免疫机制奠定了基础,也为大量制各具有生物活性的H及LL-37提供了实验依据,为临床治疗C,特别是复杂性C带来新思路。专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网http:/
