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1、冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以 CD4 为例)(1) 冰冻切片室温晾干15 分钟；(2) 用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；(3) 用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时(此步可以不洗 涤，把封闭液吸干即可)；(4) 加入 CD4 单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA), 4C孵育过夜;(5) PBS 洗 3 次，每次10 分钟；(6) 加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37C孵育1 小时；(7) PBS 洗 3 次，每次15 分钟；(8) 封片后，荧光显微镜观察结果并
2、拍照；(9) 在每切片中随机选择5 个视野计数阳性细胞数。注意事项：(1) 整个实验过程中勿使表面干燥(2) 稀释、加二抗(荧光抗体)及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如 目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注 2：所用液体(表面分子染色不用0.3%TrixtonX100)：( 1) pH7.40.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl7.65g0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4 . 2H2O5.9g+NaCI17g 定容至 2000ml,高压，pH7.27.4(2)洗涤液：0.3%TrixtonX100pH7.40.01MPBS，分装 15ml/支一20C 保存(3) 封闭液：10%NGS 0.3%TrixtonX100pH7.40.01MPBS,分装1.2ml/支一20C 保存(4) 抗体稀释液： 1%BSA0.3%TrixtonX100pH7.40.01MPBS，分装 1ml/支一20C 保存
