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1、实验方案 镧铈对铜胁迫下豌豆种子萌发和生长的影响1.La()、Ce()对重金属胁迫下种子萌发影响的显效剂量筛选(1)浓度梯度设计：LaCl3/ CeCl 3溶液配置：先配置1gL-1的LaCl3/ CeCl 3溶液母液，然后将母液分别稀释成浓度为5、10、20、40，60 mgL-1梯度浓度，调节PH（HCL/NAOH）至6.5，对照(CK)为PH调节至6.5的去离子水。重金属Cuso4浓度的设置： 10、25、50、100、200、400 mgL-1，对照用蒸馏水。(2)试材培养种子预处理：选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分别用自来水和去离子水洗净，常温下晾干备
2、用。（3）实验设置：CK，La，Ce，Cu（共4组18个浓度57个样品）（4）试材处理：选取LaCl3、 CeCl3和 CuSO4各个梯度溶液溶液，豌豆种子经预处理后用各个梯度溶液浸没处理，对照用蒸馏水，置于251浸种24h后，将处理后种子均匀排列在直径9cm、垫有2层滤纸的培养皿中，每处理加入一定量水培养（以没过种子2/3为标准），每处理3皿重复，每皿20粒。指标测定方法：种子发芽第三天测淀粉酶，第四天测发芽势，前三天测发芽指数和发芽率，第五天测量根长、茎长，第六天测根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、SOD、POD、CAT、MDA.2 La()和Ce()对重金属胁迫下种子萌发及保
3、护酶的影响(1)试材培养种子预处理：选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分别用自来水和去离子水洗净，常温下晾干备用。（2）实验设置：在上一步骤中分别筛选出LaCl3、CeCl3的低剂量、适宜剂量、高剂量三个有效浓度和CuSO4的一个有效浓度，分别记为A1，A2，A3；B1，B2，B3；C。（3）实验步骤：有以下几组：A+C:A1+C、A2+C、A3+CB+C:B1+C、B2+C、B3+CA+B+C：A1+B1+C 、A1+B2+C 、A1+B3+C、 A2+B1+C、 A2+B2+C、A2+B3+C、A3+B1+C 、A3+B2+C、 A3+B3+C酸盐缓冲液（PBS
4、）配制方法磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M） pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml 7.0 61.0 39.07.7 89.5 10.57.8 91.5 8.5 Na2HPO42H2O分子量178.05 0.2M溶液含35.61g/L Na2HPO412 H2O分子量358.22 0.2M溶液含71.64g/L NaH2PO4H2O分子量138.01 0.2M溶液含27.6g/L NaH2PO42H2O分子量156.03 0.2M溶液含31.21g/L 0.01M PBSPBS (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4
5、, and 8 mM K2HPO4，pH 7.2)PBS缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L 称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于800 ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4冰箱中即可。母液的配制：0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水0.2M NaH2PO4：称取 31.2g Na
6、H2PO4-2H2O，溶于1000ml 水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4，81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可，如：0.1M PB（PH=7.4） ：取 500ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1000ml 即可
7、。若需要 NaCl的话，加入 NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。另：其它各种另 PH值的 0.2M PB（100ml)配方 ：pH 0.2M NaH2PO4（ml） 0.2M Na2HPO4（ml）7.0 38627.8 8.5 91.50.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034105Pa)高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4冰箱中。需要注意的是，通常所说的浓度0.0
8、1M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。如果是用于免疫组化的话，则需要在配置的时候分别加入100 u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。PH 7.6 7.4 7.2 7.0H2O 1000 1000 1000 1000NaCl 8.5 8.5 8.5 8.5Na2HPO4 2.2 2.2 2.2 2.2NaH2PO4 0.1 0.2 0.3 0.4PBS缓冲液称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，
9、加水定容至1L，常温保存备用。0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)的配制： 甲液：0.05mol/L Na2HPO4溶液 ：称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸 馏水至1000ml ; 乙液：0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m1。 将甲乙液分装在棕色瓶内，于4冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表:pH 甲液ml 乙液mI7.17 70.0 30.07.38 80.0 20.07.73 90.0 10.08.04 95
10、.0 5.0实验01根系活力的测定（TTC法） （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 电子顶载天平（感量0.1g）；4. 温箱；5. 研钵；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度试管10ml；11. 试管架；12. 容量瓶10ml；13. 药勺；14. 石英砂适量；15. 烧杯10ml、1000ml。 （三）试剂：1. 乙酸乙酯（分析纯）。2. 次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3.1TTC溶液准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。4. 磷酸缓冲液（115m
11、ol/L，pH7）。5. 1mol/L硫酸用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。 三、实验步骤 （1）TTC标准曲线的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的标准比色系列，以
12、空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。 （3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、
13、结果计算 四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）四氮唑还原量（mg）/根重（g）时间(h)实验02 脯氨酸含量的测定 （二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。 （三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中；2. 3磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。 三、实验步骤 1. 标准曲线的绘
14、制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100g。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml
