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1、 天 津 市 秀 鹏 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司 Tianjin Super Biotechnology Developing Co., Ltd人类ABO血型A亚型基因分型检测试剂盒（PCR-SSP）包装规格：4/8/20人份产品代码：SUPER007-004-004 SUPER007-004-008 SUPER007-004-020 仅供研究，不用于临床诊断【产品名称】通用名称：人类ABO血型A亚型基因分型检测试剂盒(PCR-SSP)英文名称：Human ABO BloodtypeA subgroup genotyping kit【包装规格】包装规格：4 / 8 /20人份【预期
2、用途和简介】已知ABO血型系统中A亚型包括，A1、A2A3、Aw、Ax、Am & Ael等。A1亚型具有A1抗原、A抗原和H抗原，血清中含有抗B抗体；A2亚型则只有A抗原和H抗原，其血清中除含抗B抗体，还有少量抗A1抗体，在血清学实验中约25%能与A1红细胞发生的凝集反应。本试剂盒检样可为外周血、羊水、骨髓、组织、皮肤、血痕等提取的DNA，具有分型准确、快速、DNA需求少、针对中国人群设计优于同类进口试剂盒等优点。可用于个体识别，疑难配血，新生儿溶血病的产前和产后诊断、骨髓干细胞移植（血型转换期间）和器官移植，以及肿瘤或病毒感染后血型一过性改变的基因识别。【试剂盒原理】根据Genebank公布
3、的基因序列，通过针对A亚型基因不同碱基的替换或缺失设计特异性引物，设计该特异性碱基为正义链引物的3末端，由于Taq酶缺乏3-5外切酶活性，与引物3末端不相配的等位基因模板不能进行扩增，而与引物3末端相配的等位基因顺利扩增；其中每孔已经包含有内参质控品为人类生长激素（HGH）的保守片段设计，内参扩增产物作为有效试验在电泳中显现。可识别A亚型基因包括：A2、A3、 Aw、Ax、AM、Ael & O。【主要组成成分】1. 试剂盒组成包装规格组份4人份8人份20人份ABOA亚型引物板(2人份/板)2块板4块板10块板浓缩dNTP-Buffer(440l/支)2支4支10支A. ABO- A亚型引物板：
4、每人份为46孔特异性引物。B. 浓缩dNTPs-Buffer：包括200mM dNTPs 、3.5mM Mg2+、500mMKCl，100mMTris-HCl，1%TritonX-100等，使用前用无菌去离子水稀释。* 浓缩的dNTP-Buffer到货后，要根据每次的用量稀释后进行分装，不可反复冻融。* 分装的浓缩Buffer在室温溶解后，其颜色应为粉红或浅紫色。如果浓缩Buffer溶解后的颜色不是指定的颜色，则不能使用。* 如果在运输或储存中发现分装的浓缩Buffer中的盐已经沉淀了，要通过延长在室温（20-25）下的混匀时间来使其重新溶解。2. 操作过程中用到的其他设备及试剂：- 10l-
5、1000l的微量移液器和相应规格量筒；- 涡旋混匀器；- 低速离心机；- 加热板或微波炉加热琼脂糖凝胶溶液；- 电泳设备/电源规格要求（100-150V /cm)；- 紫外光成像仪或紫外光凝胶成像系统；- DNA扩增仪，PCR密封压力垫；- 人类基因组DNA提取试剂盒；- Taq聚合酶(5units/l)；- 电泳染色剂；- 1 TBE溶液；- 琼脂糖（分子生物学级）；- 液体石蜡（分析纯）。【储存条件及有效期】1储存条件： a）-20保存，避免反复冻融。 b) 室温操作。2有效期：12个月，生产日期及有效期见试剂盒外包装。【适用仪器】DNA扩增仪、水平电泳槽、紫外/凝胶成像仪【样本要求】1.
6、 提取人类基因组DNA。2. DNA样品用1TE(pH8.0)溶液溶解，DNA最佳浓度30-50ng/l，A260/A280值为0.9-1.6。3. DNA样品不可重新溶解在含有钙螯合剂的溶解液中，例如大于0.5 mM浓度的EDTA。4. DNA模板在4 或-20 保存，4 以下运输。【电泳操作方法】一、2.5%琼脂糖凝胶的配制:1. 2.5g琼脂糖加入100ml 0.5TBE（硼酸缓冲液），加热溶解后加入适量电泳染色剂，混匀。2. 将适量凝胶溶液加入凝胶槽槽中，插入孔梳，前后水平移动均匀溶液，凝固后拔出孔梳。二、PCR（1.5 h）循环参数：196/2 min1 cycle296/20 se
7、c，68/60 sec5 cycles396/20 sec， 65/45 sec，72/30 sec10 cycles496/20 sec， 62/45 sec，72/30 sec15 cycles572/1 min1 cycle64三、必须满足的试验条件：1. 从20冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上使用。2. 冷冻引物板放置室温解冻后立即使用。四、实验过程中的注意事项：1. PCR前后使用的加样器具要分开，不得混用。2. 所有检样均应按照潜在的传染物处理。3. 当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，避免裸视紫外光源。4. PCR仪必须配有不间断电源。五、操作步骤：1. 配制1dNTPs
8、-Buffer：440l浓缩dNTPs-Buffer + 560l无菌水2. PCR前操作（1人份）：名称体积备注dNTPs-Buffer460lTaq酶（5U）3.6lDNA50l合计513.6l混匀，每孔10ul，石蜡油15-20l3. 每孔10l，石蜡油15-20l。*操作中需严格避免孔间的交互污染。4. 密封膜封好后PCR。5. 取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。PCR产物4可保存48小时。6. PCR产物10l置2.5%琼脂糖凝胶电泳/120-150V电泳15-20分钟。7. 紫外光下观察结果并拍摄成像。8. 根据提供的结果分型表（附二）解释分型结果。六、质量控制程序：阴性
9、扩增反应必须出现阳性内参质控带；阳性扩增反应的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。七、实验结果模拟判读图：A. 胶体解释 阳性反应 阴性反应 无扩增 加样孔： 内参质控带： 阳性分型带： 引物二聚体带： B. 预期结果： 阳性扩增反应：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带 阴性扩增反应：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带C. 根据所附的“结果分型表(附二)”或该试剂配套软件进进行分型结果的判定【参考值（参考范围）】本试剂盒为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读。【检验方法的局限性】PCR基因扩增技术具有极大的检测灵
10、敏度，但同时其对检测中的错误也有极大的放大作用。对于PCR检测结果的报告必须慎重，必须在有相应严格质控措施（如内参质控）并符合人类基因座位规则的情况下报告结果，对于人类稀有位点的报告必须重复测定。操作PCR基因扩增技术影响因素很多，操作不当会造成假阴性、假阳性结果，PCR临床应用实验室必须要符合中国国家PCR实验室技术规范要求。该试剂盒检测的人类等位基因包括的特异位点请参见引物孔位图 (附一) 标注的信息，未注明的等位基因不在该试剂盒的检测范围之内。【产品性能指标】本试剂盒引物通过PCR-SSP和PCR-SBT比较了随机收集的20份血样本，结果完全一致。【注意事项】本试剂盒仅用于科研。【故障排
11、除】问题潜在因素解决方法未见扩增条带或出现扩增条带很弱DNADNA数量不准确存在PCR抑制剂（例如0.5mM以上EDTA）调整DNA浓度后重复实验重新制备DNA，增加洗涤次数。Taq聚合酶酶的活性降低重复实验：更换Taq酶。压力垫压力垫磨损在使用了PCR300个循坏后更换压力垫。出现非特异性条带DNA用量过多污染重复试验：调整DNA浓度。确认污染源。Taq聚合酶用量过多重复实验，使用说明书推荐的数量。阴性质控孔出现扩增带PCR前污染污染消除污染因素。【生产企业】生产企业：天津市秀鹏生物技术开发有限公司注册地址：新产业园区华苑产业区海泰发展六道6号海泰绿色产业基地F座3门601室生产地址：新产业
12、园区华苑产业区海泰发展六道6号海泰绿色产业基地E座402室、F座3门601室邮编：300384电话：+86 22 85689192/85689195传真：+86 22 85689199网址：【医疗器械注册证书编号】【产品标准编号】【说明书批准及修改日期】【参考文献】1. Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system, 1: weak subgroups: A3 and B3 alleles. Vox Sang. 1993;64:116-119
13、.2. Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, Hakomori S, Harris T. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system, 3: Ax and B(A) alleles. Vox Sang. 1993;64:171-174.3 Barjas-Castro ML, Carvalho MH, Locatelli MF, Bordin S, Saad ST. Molecular heterogeneity of the A3 subgroup. Clin Lab Haematol. 2
14、000;22:73-78.4. Olsson ML, Chester MA. Polymorphisms at the ABO locus in subgroup A individuals. Transfusion. 1996;36:309-313.5. Olsson ML, Chester MA. Heterogeneity of the blood group Ax allele: genetic recombination of common alleles can result in the Ax phenotype.Transfus Med. 1998;8:231-238.6. Fukumori Y, Ohnoki S, Shibata H, Nishimukai H. Suballeles of the ABO blood group system in a Japanese p
