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1、Q-PCR 实验流程一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开 15-20 分钟。超净台前做实验， 需佩戴干净的橡胶手套 / 一次性薄 膜手套， RNA 抽提需带口罩。取 EP 管/枪头时需用镊子，不可以 用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/枪头后，袋子及时封好。橡 胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移 液器在一天工作结束后调至最大量程， 并用 75%乙醇清洁移液器， 枪 头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不 要在超净台前讲话。二、总 RNA 抽提1）细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS洗两次后，用 1ml枪将 PBS吸干净
2、， 加入 1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min；组织样品用液氮充分研磨， 加入 1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀， 室温放置 5min 使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入 200l氯仿，剧烈振荡混匀 30s，使水相和有机相充分接触，室温 静置 3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序 也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4下， 14,000g 离心 15min，可见分为三层， RNA 在上层水相，移 至另一个新的 RN
3、ase free EP管；（用 20-200ul 的枪吸取上清，吸上清 时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀 RNA ：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8 次）（不 应用振荡器混匀），室温静置 10min；5）4下， 14,000g离心 10min，收集 RNA 沉淀（如离心后仍不见 EP管 底部有沉淀，应将 EP管放置在-80 度冰箱过夜，继续在 4下， 14,000g 离心 10min，收集 RNA 沉淀），去上清；6）用 75乙醇洗涤两次（ 12,000g 离心 5min）（加入乙醇后只需轻轻颠 倒 EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），
4、超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀。三、去基因组使用 RNase-free的 DNase ?（Promega），按以下体系配置反应液， 37 消化 30min，65灭活 10min。RNA30lDNase ?20l10 x buffer10lH2O(RNase free)39.5lRNasin0.5l总体积100l然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚 /氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min，后 14,000rpm， 离心 15min，取上清。2）加入等体积的氯仿， 上下颠倒混匀，静置分层后 14,0
5、00rpm，离心 15min， 取上清。3）加入等体积异丙醇， 轻柔地充分混匀（颠倒 6-8 次），-20静置 15min；4）4下， 14,000g离心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；5）用 75乙醇洗涤两次（ 12,000g 离心 5min），超净台风干；6）加入适量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀。四、总 RNA 纯度和完整性检测1）纯度检测：取 1l RNA 样品 50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 OD 值， OD260/OD280 的比值大于 1.8，说明制备的 RNA 较纯，无蛋白质污染。2）总RNA 完整性检测：取RNA 样品 1，l1琼脂糖凝胶电泳 80V2
6、0min，EB 染色 10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA 的 5s rRNA， 18s rRNA 和 28s rRNA 条带，三条条带完整的话即可证明总 RNA 抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA ：1） 在 RNase free的 PCR 管中配置下列溶液Total RNAH2O1.0g l总体积12l2) 将上述溶液吹打均匀， 置 85保温 5min，使 RNA 变性。随后立即冰上致冷， 以防止 RNA 复性；3) 在该 PCR 管中加入下列试剂( Promega)oligo（dT）0.5lRandom primer0.5l10mM dNTP2.0lRNase inhib
7、itor0.5l5 x buffer4.0lM-MLV0.5l总体积8.0l4) 将上述 20l反应溶液 30保温 10min；5) 42保温 50min；6) 85保温 10min；7) -20 保存。2. microRNA ：使用茎环逆转录法，原理如下图：1） 在去 RNase的 PCR 管中配置以下溶液total RNAX 个 miR 逆转录引物H2O1.00.5*Xg l总体积12.5l2）将上述溶液混匀， 85孵育 5min，以打开 RNA 二级结构。随后立即置于冰 上，以防止 RNA 复性再次恢复二级结构；3） 在另一去 RNase的 PCR 管中配置以下溶液：10mM dNTP
8、(promega)2.0lRNase inhibitor (promega)0.5lU6 逆转录引物0.5l5x buffer4.0lM-MLV (promega)0.5l总体积7.5l4）将 3）溶液加入到 1）溶液中，混匀后 30保温 10min；5）42孵育 50min；6）85孵育 10min 灭活逆转录酶。四、定量 PCR 检测1.引物测试：根据 mRNA 设计的引物正式实验前需进行 qPCR 测试其特异性和扩增效率， 具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性， 选择标准为： 单峰且峰形 偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线
9、峰。 若设计的多对引物熔解曲线均显示 特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择 Ct 值小、扩增效率高的引 物进行正式实验。2确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。 （1）一个样 品的加样尽可能安排在同一行 （2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上， 则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3正式实验：体系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul （TOYOBO）（ 使用前需振荡均匀 ）上游引物0.5ul （10uM）下游引物0.5ul （10uM）总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分
10、装会有损失，一 般多配 0.5份-1 份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后 15ul 每管分 装至 8 连管中。3cDNA 用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为 1:20 稀释，如遇到基因表达低的 样品，则适当降低稀释比例至 1:10 或 1:5。cDNA 按一定顺序排好后，即可加至 刚配好的反应体系中。 加样完毕，盖好八连管盖， 并在八连管盖最上沿的边上标 记好 1-12 的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中 间透明的荧光采集区域， 且保证每孔均盖紧， 否则影响重复性或可能出现熔解曲 线峰漂移。）4把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五上机：5
11、.1 先开电脑，进入 Windows 界面。接着打开 PCR 仪电源开关。5.2 打开 7500 软件，选择“新建”，在“ Template”下拉菜单中选择“ 60”或 “65”（普通基因检测为“ 60”， MicroRNA 检测为“ 65”）5.3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔 位，剔除无反应管的孔位。5.4 点击 File 菜单中 Save，输入要保存结果的文件名，命名为日期 -上机时间 - 客户名字简写，如 100830-1008-WL表示 8月 30日 10点 08分魏立的实验。5.5 点击 Start 键，开始运行程序。5.6 程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭 ABI PRISM 7500SDS 软件、 PCR仪电源开关。5.7 在 7500 软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称， 分类保存 好结果文件。反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。 （同 一个客户的三次重复实验， 则只需保存其中一次重复的反应管即可， 其余可丢弃）
