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1、鸭瘟病毒研究进展徐晓娟1 综述 郭霄峰1 XXX2 审阅 （1华南农业大学兽医学院 ， 广东 广州 510642； 2广州格雷特生物科技有限公司，广东 广州 ）鸭瘟（Duck plague, DP），又名鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis, DVE），是鸭、鹅和其他雁形目禽类的急性、热性、败血性传染病，是目前对世界范围内水禽养殖业危害最为严重的疫病之一1。该病已被国际兽疫局认定为B 类传染病，我国动物防疫法也将其列入二类动物疫病2。荷兰学者Baudet3于1923 年首次发现该病后，其流行范围逐步扩大，相继在法国(1949)、美国(1950)、印度(1963)、比利时(19
2、64)、英国1972)、泰国(1976) 和加拿大(1976)被发现。1957 年，黄引贤在我国广州报道发现了鸭瘟。19571965 年，本病广泛流行于我国南部、中部和东部的一些养鸭业较为发达的省市4，1983 年，廖德惠报道了四川省存在鸭瘟，并且分离到鸭瘟病毒。至今，全国各地均有本病的报道。目前，鸭瘟仍然是阻碍我国养鸭业发展的重要传染病之一。1 鸭瘟病毒基本特性DP的病原是鸭瘟病毒（DPV），又名鸭病毒性肠炎病毒（DEV），属疱疹病毒科、疱疹病毒亚科，也称鸭疱疹病毒型( Duck hcrpcsivirus)5，是一种泛嗜性全身性感染的病毒。DPV 为线性双链DNA病毒，成熟病毒粒子直径150
3、380nm，呈球形，有囊膜，在CsCl 中浮密度为1.272 g / ml，无血凝特性和血细胞吸附作用。除有芯髓、衣壳、囊膜等常见结构外，在衣壳和囊膜间还有疱疹病毒所特有的皮层成分6。，DPV 各毒株在毒力上存在差异，但在免疫学特性上却是相同的，迄今为止，只发现一种血清型。该病毒对热、pH及脂溶剂（乙醚、氯仿等）均较敏感，5610 min 会丧失感染力，805 min 即可死亡，在pH3和pH11的环境下也很快被灭活7。2 鸭瘟病毒粒子结构DPV完整的病毒粒子由芯髓(core)、衣壳（capsid)、囊膜（envelope）及衣壳和囊膜间的皮层结构（又称外膜）所组成。病毒芯髓由蛋白与双股DNA
4、缠绕而成，在衣壳内致密排列，直径约为3540nm，也有报道称为74nm。衣壳为对称的二十面体，表观呈现正六角形，它由162 个相互连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒组成，是疱疹病毒最重要的形态特征。芯髓与衣壳一起被称为核衣壳或裸露的病毒子，直径约为95105nm。核衣壳穿过宿主细胞核膜进入胞浆或其空泡中，外面包上一层由蛋白质组成的疱疹病毒所特有的皮层成分，最后绕以囊膜形成成熟的病毒子。余克伦7等在电镜下观察纯化的DPV直径为184nm，核衣壳直径92nm，而芯髓在衣壳内排列致密，直径为74nm，衣壳外包有明显的囊膜，还可见到多量的囊膜融合的双病毒颗粒和四病毒颗粒。2008年，郭宇飞8等的电镜负
5、染观察结果表明，病毒粒子呈圆形, 多数直径为150 nm 左右, 只有1个核衣壳, 少数病毒粒子直径可达300 nm, 有2个或多个核衣壳。3 鸭瘟病毒的装配与释放经研究报道，DPV 可在914 日龄鸭胚中生长繁殖，并引起胚胎死亡。病毒在鸭胚生长适应以后还可感染鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生蚀斑并形成核内包涵体。DPV 还可在成纤维传代细胞系CCL-141中生长并具有蚀斑易于观察的特点, 但病毒产量较原代细胞少5.6倍32。有研究报道，一株DPV 弱毒接种鸭胚成纤维细胞后，对其生长情况进行的研究结果表明，接毒后4 h可在胞内检测到DPV，在48h病毒滴度达到最高；接毒后68 h可在胞外检测到DPV
6、，在60h病毒滴度达最高，病毒在细胞内的复制周期为68 h，成熟病毒子的释放与细胞发生病变的时间相一致。丁明孝9的研究结果进一步证实，DPV DNA的合成是持续进行的，被感染细胞中，病毒DNA的复制与壳体的装配，病毒粒子的成熟与释放是同时进行的。对DPV 弱毒株在鸡胚成纤维细胞中的成熟和释放方式进行研究发现，DPV 获得囊膜的方式有两种：一是核衣壳可通过空泡出芽的方式获得囊膜；二是在核内依靠膜物质在核衣壳周围积累而获得囊膜。深入研究结果表明，DPV 存在两种装配方式：（1）病毒核衣壳进入宿主细胞后，在核内获得皮层蛋白，部分核内膜形成囊膜从而成为成熟病毒子，称为胞核装配方式；（2）核衣壳通过内外
7、核膜进入胞浆，在其中获得皮层蛋白，然后通过向高尔基体或者内质网腔出芽释放时获得囊膜形成成熟病毒子释放到细胞外，称为胞浆装配方式10,11。前者是DEV 核衣壳主要的主要装配方式。但是，翟中和等12通过大量的观察和应用电子显微镜放射自显影技术， 证明了DPV 第二种装配方式的存在，即在细胞质内的装配过程。其后丁明孝9也观察到DEV 在细胞质中的成熟过程。DEV 的复制过程，特别是在病毒复制的前期阶段，比如基因的转录、蛋白合成以及DNA 复制等仍然缺乏详细的资料。4 鸭瘟病毒基因组结构及分子生物学研究4.1 DPV基因组结构DPV的DNA与其它 -疱疹病毒基因组结构相似，整个基因组由UL（uniq
8、ue long）区和US(unique short )区组成，中间有IR（internal repeat）区相隔，两端有TR（terminal repeat）区相连。Ying Wu13等对DPV CHv株全基因组测序结果表明，该株DPV基因组全长由162,175个核苷酸组成，G + C含量为44.89%，与之前报道的DPV基因组G + C含量64.3%略有差异。该毒株5UTR长为5685bp，包含25个TATA盒、8个CAAT盒、8个poly(A)尾和1个GC盒，而3UTR则分别包含3个TATA盒、13个CAAT盒、 4个poly(A)尾和 7个GC盒，一般认为它们均在一定程度上调控基因的转录
9、水平。同时，3UTR拥有7个串联重复序列，其长度达到40nt，可定义为小卫星。4.2 DPV分子生物学研究相对于疱疹病毒科其它成员，人们对DPV基因组的研究起步较晚。1998年，Plummer等用Hind消化DPV得到约1.95kb的DNA片段，对该片段测序分析结果表明，该片段与水痘带状疱疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）的UL6和UL7部分基因同源14。随后，Hansen15等报道了DPV UL30基因的部分序列。2002年，郭霄峰的研究表明：DPV的UL6和UL7基因在不同毒株中高度保守16。随着对DPV基因组结构的深入研究，多个DPV基因现已被成功克隆并进行了
10、序列分析。韩先杰17等利用兼并PCR的方法成功克隆了DEV 完整的TK、gH、UL24 基因和UL25、UL26 基因的部分序列， 同时实现了gH 部分基因、UL24 及TK 基因在大肠杆菌内的表达； 并首次以DEV TK 基因作为同源重组的区域， 将LacZ 基因表达盒插入TK 基因内构建鸭瘟病毒转移载体，为以鸭瘟病毒为载体构建重组鸭瘟病毒活载体疫苗创造了条件。文明18等应用鸟枪法成功构建了DPV 基因文库，获得大于100bp的ORF共187个，首次克隆并鉴定了DPV的核衣壳蛋白基因。陈淑红19、高亚东20等研究者应用靶基因步移PCR法分别获得DPV部分基因的完整ORF，研究结果均指向DPV
11、应归类为-疱疹病毒亚科的马立克病病毒属。李阳21分别以DPV UL35、UL50和SORF3部分基因为七点设计引物，扩增出DPV基因组未知序列UL36、UL51UL55、US2和US3。Yan Zhao等获得了DPV US10、US2、US3、US4和US5并对这些基因进行了分子水平上的分析，认为DPV与-疱疹病毒亚科的同源关系最近。随着基因组序列的深入研究，相关基因的功能研究也逐渐开展起来。李慧昕表达了UL27基因中段UL27-MHE UL6基因的UL6-1和UL6-2两段，应用Western Blotting和间接免疫荧光方法进行了检测，并制备了针对UL19-C段蛋白的单克隆抗体，拟对UL
12、19抗原表位进行初步定位。潘华奇以纯化的重组gB1蛋白作为包被抗原，初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA。孙涛等对DPV UL6基因B细胞表位进行了预测以及对其主要抗原域进行了原核表达，以兔抗DPV多克隆抗血清进行Western Blotting分析，多抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。刘峰源对不含信号肽部分的gC基因胞外区进行了原核表达，并证明了糖蛋白gC上含有中和抗原表位并且能够刺激机体的细胞免疫。金映红21将DEV gH 蛋白切除信号肽和跨膜区而保留抗原区的截断蛋白获得有效表达，且重组蛋白能与疫苗免疫的DEV 阳性血清发生特异性反应， 具有较好的抗原反应原性，采用以此表达产
13、物作为抗原建立DEV 的血清学检测方法和研究DEV 感染过程中gH 的作用研究奠定了基础。李子剑将绿色荧光蛋白插入到DPV基因TK、US2、US1和US10，证明这四个基因为DPV复制非必需区22。5 分子生物学诊断方法随着现代分子生物学的迅速发展，鸭瘟病毒的诊断已经从传统的诊断方法过渡到如今的分子生物学方法。目前主要利用抗原抗体反应和核酸杂交等原理对该病作出正确诊断23。现代分子生物学方法包括，聚合酶链式反应（PCR），微量固相放射免疫试验（Micro-SPRIA）,酶联免疫吸附试验（ELISA），间接免疫荧光试验（IFA），斑点杂交( Dot-hybridization)等，近来，郭宇飞9
14、等建立了用电镜负染检测鸭瘟病毒的方法。随后，贾仁勇24等建立了有效检测鸭瘟病毒UL24蛋白的抗原捕获酶联免疫吸附法（AC-ELISA），接着，沈婵娟25等又研制出检测鸭瘟病毒的免疫胶体金层析试纸条。PCR检测DPV方法的建立，是在成功获得了DPV部分保守基因片段核酸序列的基础上发展起来的，Plummer 等14于1998年首次成功利用该方法检测到鸭瘟病毒(DPV)DNA ，并且确定了PCR 的最低检测量为1fg，整个实验过程仅需3648h。随着研究者们的深入研究，目前，应用该方法能够检测到1pg26甚至0.1pg27的病毒DNA，并且检测时间缩短至12h。2006年，汤承等28开发成功的SYB
15、R Green实时定量PCR(real-time PCR)检测技术将检测时间缩短至3h,对本病的快速诊断具有极其重要的作用。该方法由于其敏感、特异、简便、快速等特点，对于隐性带毒状态禽类的检测具有重要意义，目前已有应用该方法对鸭群进行检疫的报道29。但是，PCR 检测方法需要较昂贵的仪器和试剂，并且在进行血液检测时，偶尔会出现严重的拖尾现象，影响结果的判断，此外，还要求兽医工作者具有良好的操作技能，因此，该方法不适宜在基层推广。微量固相放射免疫试验（Micro-SPRIA）的原理是抗原抗体结合反应，该技术是利用表面能吸附抗体的塑料或其他材料作为固相载体，用同位素标记抗体或抗原，以测定相应抗原或
16、抗体的一种微量检测技术30。该技术广泛应用于各种病原的检测，徐耀基等31于1992年便开始使用Micro-SPRIA检测DPV，该方法可直接检测肝、脾、脑及血清等病料，人工发病48h后陆续从病鸭、鹅的肝、脾、脑及血清等材料中检出DPV，其中肝、脑的检出率为80%，最高可达到100%。它能够在感染DPV 的鸭鹅刚出现体温升高特征性症状和病变尚未出现之前对该病进行检测，适宜发病早期的诊断。Micro-SPRIA 特异性强、敏感性高、快速和经济，标记抗体对抗原纯度要求不高，可广泛应用于微量可溶性抗原、抗体的检测，对疫情监测和交通口岸的鸭检疫具有重要的应用价值。ELISA 方法用于DPV病原检测具有简便、快速、敏感、特异等优点, 能在临床症状出现之前从肝、脾、粪便和血液中检出DPV,
